Реакция двухвалентного железа с тетраоксанами и триоксоланами

Реакция железа гема приводит к образованию окси-радикала, который затем перегруппировывается в углерод-центрированный радикал, что было подтверждено с помощью ловушки радикалов – ТЕПМО [23].

Схема 1.11.

Далее в литературе рассматриваются два возможных  механизма действия. По одному пути образовавшийся углерод-центрированный радикал непосредственно взаимодействует с малярийным паразитом, приводя к его гибели. По другой версии этот радикал алкилирует гем и уже алкилированный аддукт гема проявляет антималярийную активность (схема 1.12):

 

 

Схема 1.12.

В гемоглобине  железо находится преимущественно  в двухвалентном состоянии. При  деградации глобина и высвобождении  гема, протопорфирин-IX способен высвободить молекулярный кислород, который индуцирует совокупность окислительных реакций. Результатом является гибель паразита. Чтобы избежать инициированного гемом окисления, высвободившийся гем превращается в окисленную форму микрокристаллический агрегат гема, называемый гемозоином. Гемозоин образуется преимущественно в результате димеризации гема. Эти димеры группируются посредством водородных связей, что приводит к субстанции, нерастворимой в биологических условиях, и аккумулируется в пищеварительной вакуоли. Гемозоин обычно называют полимером, но это не ковалентный полимер, энзимы паразита, участвующие в образовании этой субстанции, не являются полимеразами.

Взаимодействие  аддуктов гема-артемизинина с богатым  гистидином белком, который вызывает агрегацию гема, превращает его в  гемозоин. Этот протеин содержит повторяющуюся последовательность Ala-His-His, что составляет 76% от указанного выше протеина. Данный протеин способен связать приблизительно 50 молекул гема при рН 7 и 17 – при рН 4.8. Таким образом, богатый гистидином белок служит основой для инициирования цепей гемозоина. Согласно недавним исследованиям, аддукты гема-гемозоина, (схема 1.12) способны взаимодействовать с этим белком с более высокой эффективностью, чем сам гем, тем самым, вытесняя гем из этого белка. Связывание аддуктами гема-артемизинина с высокой эффективностью может послужить помехой изоляции токсического гема (вредного для паразита) в качестве гемозоина, таким образом, отравляя паразита продуктами его жизнедеятельности.

В ряде работ  была исследована кинетика взаимодействия триоксоланов с соединениями двухвалентного железа. В условиях псевдопервого порядка были измерены константы скорости реакции пероксидов с Fe²⁺ [23].

Проводились попытки  установить корреляцию между свойствами пероксидов и их биологической активностью. В ходе этих экспериментов выяснилось, что реакционная способность пероксида по отношению к Fe²⁺ слабо коррелирует с его антималярийной активностью. С другой стороны, пероксиды, которые не реагируют с железом, вообще не проявляют никакой активности. В этой связи был сделан вывод о том, что реакционная способность пероксида по отношению к железу – необходимое, но недостаточное условие для проявления биологической активности.

В заключение отметим, что существует корреляция между степенью индуцированного железом алкилирования гема и биологической активностью пероксида [24], и, по мнению авторов этой работы, роль этого фактора значительнее, чем реакционная способность пероксида по отношению к железу.

 

 

 

 

 

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Экспериментальные установки

2.1.1. Установка для измерения интенсивности ХЛ в видимой области спектра

Измерения интенсивности  хемилюминесценции (ХЛ) в видимой области спектра проводили в светонепроницаемой камере на сконструированной в лаборатории установке рис 2.1. В качестве детектора излучения использовали фотоэлектронный умножитель ФЭУ-119, чувствительный в видимой области спектра от l = 330 до 700 нм рис 2.2, питание которого осуществлялось от высоковольтного стабилизированного выпрямителя ВС-22. Сигнал с ФЭУ поступал на вход компенсационного самописца К-201. На днище камеры, над фотокатодом ФЭУ, размещался медный термостатируемый блок, в который помещали кювету с исследуемым раствором. Над кюветой располагалось приливающее устройство (вбрасыватель), позволяющее производить смешение реагентов в процессе наблюдения хемилюминесценции.

Спектральная  область ХЛ выбиралась с помощью  граничных светофильтров, расположенных в кассете между дном кюветы и фотокатодом ФЭУ. Необходимый светофильтр устанавливался на пути светового потока путем вращения кассеты.

Сигнал с  ФЭУ поступал на высокоомный вход компенсационного самопишущего потенциометра К-201, затем - на  цифровой многоканальный самописец S-Recorder-2, который был связан с системным блоком компьютера посредством USB-интерфейса.

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2.1. Установка для регистрации ХЛ.

1-отвод для подачи аргона, которым осуществлялось вбрасывание реагентов;

2-термостатируемая рубашка для вбрасывателя;

3-капилляр для подачи газа (О₂/Ar), которым осуществлялось перемешивание реагентов во время реакции;

4-реактор;

5-термостатируемая рубашка для реактора;

6-ФЭУ-119;

7-самописец, цифровой самописец, системный блок;

8-стабилизатор напряжения.

 

 

 

Рис. 2.2. Спектральная характеристика ФЭУ-119.

 

 

2.1.2. Стандартные приборы

Спектры люминесценции  снимали с использованием спектрофлуориметра СМ-2203 (Белоруссия, «Solar»).

 

2.2. Очистка  растворителей и реагентов

Растворители, используемые в работе, очищали и  осушали по приведенным ниже методикам, и хранили в эксикаторе, заполненном CaCl₂.

Ацетон марки “осч“ кипятили над K₂CO₃ в течение 12 часов. Затем, отделив от карбоната калия, перегоняли (Т_кип = 56^оС) над молекулярными ситами 3Å. Растворитель имел предел пропускания при l = 330 нм для поглощающего слоя 1 см [25].

Хлористый метилен марки “ч“ промывали концентрированной серной кислотой, затем водным раствором щелочи и водой. После высушивания над хлористым кальцием, перегоняли (Т_кип = 40^оС) над пятиокисью фосфора. Растворитель имел предел пропускания при l = 230 нм для поглощающего слоя 1 см [25].

Хлороформ марки “хч“ промывали концентрированной серной кислотой, затем водой. После высушивания над хлористым кальцием, пропускали через колонку со свежепрокаленной (при 250^оС) нейтральной окисью алюминия и перегоняли (Т_кип = 61^оС) над P₂O₅.

Ацетонитрил марки “чда“ (Т_кип = 81^оС) кипятили над K₂CO₃ в течение 12 часов. Затем, отделив от карбоната калия декантацией, перегоняли над P₂O₅.

Воду - очищали двукратной перегонкой.

2.3.Методики  синтеза

Синтез 1,2,4-триоксоланов на основе тритерпеноидов

Тритерпеновые 1,2,4-триоксоланы 1, 2 получены путем низкотемпературного озонолиза ангидробетулина, образующегося при дегидратации аллобетулина под действием PCl₅. Важно отметить, что эти соединения содержат в своей структуре два потенциальных фармакофорных фрагмента с различным механизмом действия: пероксидную группу и тритерпеновый остов.

1

2

2.4.Методы  анализа

Анализ  методом тонкослойной хроматографии (ТСХ)

Анализ концентрации триоксоланов методом ТСХ проводили  следующим образом. В элюционном варианте на слой сорбента наносили капли (объемом 1-5 мкл) анализируемого раствора в хлороформе и погружали край пластинки в элюент (смесь СHCl₃-EtOAс 40:1), который находился на дне герметично закрываемой стеклянной камеры. Элюент продвигался по слою сорбента под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещалась в том же направлении.

После завершения процесса пластинку вынимали из камеры, продували воздухом растворитель, проявляли в 10%-ом растворе серной кислоты и высушивали при 100-120^о С. При этом обнаруживали разделенные зоны,  образующие окрашенные пятна с компонентами разделяемой смеси.

2.5. Методика  регистрации хемилюминесценции  в видимой области спектра

Реакция триоксоланов 1, 2 с FeCl₃/ L-цистеин в присутствии родамина Ж

К раствору пероксида 1 или 2 (0.25 мл, 6·10^-3 моль·л^-1) в смеси CH₃CN/H₂O (1:1) добавляли раствор гидрохлорида L-цистина (0.25 мл, 1.2·10^-2 моль·л^-1) в смеси CH₃CN/H₂O (1:1) и затем переносили полученный раствор в термостатируемую при 70˚С кювету. К раствору в кювете (в течение менее чем 1 секунды) из термостатируемого при 70˚С вбрасывателя приливали 0.5 мл раствора родамина Ж и FeCl₃ в CH₃CN/H₂O (1:1), так что конечные концентрации реагентов в реакционной смеси составили: [пероксид] = 1.5·10^-3 моль·л^-1, [FeCl₃] = 1.5·10^-3 моль·л^-1, [L-цистеин] = 3·10^-3 моль·л^-1, [родамин Ж ] = 1.5·10^-3 моль·л^-1 и регистрировали хемилюминесценцию в видимой области спектра. Спектр ХЛ записывали, используя методику «опыт-точка», с помощью граничных светофильтров, с учетом спектральной чувствительности фотоумножителя. Во время реакции кювета с реагентами барботировалась медленным током аргона или кислорода.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Для исследования хемилюминесцентных свойств 1,2,4- триоксоланов были использованы пероксиды, указанные  в схеме 3.1. В ряду ди- и тритерпеноидов обнаружено немало фармакологически ценных соединений. Таким образом, полученные триоксоланы 1, 2 содержат в своей структуре два потенциальных фармакофорных фрагмента с различным механизмом действия: пероксидную группу и тритерпеновый остов.

 

Схема 3.1

 

3.1. Хемилюминесценция в реакциях 1,2,4- триоксоланов с соединениями железа.

Для исследования перспектив использования метода хемилюминесценции  для изучения свойств биологически активных пероксидов был проведен скрининг их химических трансформаций с целью  выявления тех из них, которые сопровождаются излучением света. Одним из приоритетов поиска стали биологически важные реакции пероксидов с соединениями железа, которые, играют ключевую роль в проявлении биологической активности. Как оказалось, пероксиды на основе природных соединений действительно способны к образованию электронно-возбужденных состояний в ходе реакции с соединениями железа. Мы показали, что взаимодействие лекарственного препарата артемизинина, потенциально биологически активных пероксидов 1 и 2 с FeCl₃ в присутствии гидрохлорида L-цистеина и родамина Ж сопровождается свечением в видимой области спектра:

Была определена область люминесценции, возникающей  при взаимодействии пероксидов с Fe(III) в присутствии L-цистеина. Как выяснилось, свечение сосредоточено в области l = 540 - 620 нм, что совпадает со спектром люминесценции родамина Ж в смеси CH₃CN/H₂O, а следовательно, родамин Ж является эмиттером наблюдаемой ХЛ (рис. 3.1).

Как можно видеть из рисунка 3.2, проведение реакции в атмосфере кислорода значительно увеличивало светосумму ХЛ по сравнению с процессом, осуществленным в аргоне, а анализ реакционной массы, сделанный методом ТСХ после завершения спада свечения, показал отсутствие пероксидов 1 и 2 в реакционной смеси. Этот экспериментальный факт не вызывает удивления, поскольку известно, что биологически активные артемизинин, триоксоланы разлагаются под действием каталитических количеств Fe³⁺ в присутствии восстановителя L-цистеин или дитионата натрия) с образованием свободных радикалов [24].

Учитывая это  обстоятельство, а также влияние  кислорода на поведение ХЛ, можно  предложить, что свечение генерируется по механизму рекомбинации перокси-радикалов посредством передачи энергии с образующихся возбужденных карбонильных соединений на активатор - родамин Ж (схема 3.2). С другой стороны, вполне возможно, что ХЛ возникает непосредственно в ходе реакции красителя либо с пероксидом, либо с реакционноспособными радикалами, образующимся при взаимодействии его с соединениями железа.

 

 

 

 

Рис. 3.1. 1-спектр хемилюминесценции, возникающей в реакции пероксида 1 с FeCl₃ в присутствии L-цистеина и родамина Ж. ([пероксид 1]=1.5·10^-3 M, [FeCl₃]= 1.5·10^-3 M , [Rd]= 1.5·10^-3 M, CH₃CN/H₂O 1:1, 70 °С, барботаж O₂). 2-спектр флуоресценции родамина Ж ([Rd]=1·10^-5 M, CH₃CN/H₂O 1:1, λ_ex=488 нм).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3.2. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от времени в реакции пероксида 2 с FeCl₃ в присутствии L-цистеина и родамина Ж ([пероксид 2]=1.5·10^-3 M, [L-цистеин]= 3·10^-3 M, [FeCl₃]=1.5·10^-3 M, [Rd]=1.5·10^-3 M, CH₃CN:H₂O 1:1, 70^oC). 1-реакция проводилась в атмосфере О₂, 2-реакция проводилась в атмосфере Ar.

 

 

Схема 3.2.

 

Стоит отметить, что похожие результаты – свечение красителя в системе пероксид - FeCl₃/L-цистеин/родамин Ж, влияние атмосферы кислорода на интенсивность ХЛ были обнаружены также и для природного триоксолана абиетиновой кислоты. Сделанное наблюдение расширяет круг светящихся пероксидных объектов и свидетельствует о том, что метод ХЛ потенциально может использоваться для обнаружения пероксидов в химических и биохимических системах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВЫВОДЫ

 

1. Обнаружена хемилюминесценция в реакциях нового класса органических пероксидов – 1,2,4-триоксоланов с FeCl₃ в присутствии гидрохлорида L-цистеина и родамина Ж. Установлено, что краситель является эмиттером наблюдаемого свечения.