Автор работы: Пользователь скрыл имя, 17 Апреля 2013 в 12:17, доклад
В технологии интерферона для приготовления рабочих растворов дезинфицирующих средств, мытья посуды используют воду очищенную, для приготовления рабочих растворов, применяемых непосредственно в технологическом процессе, используют воду для инъекций.
Воду очищенную и воду для инъекций получают на участке водоподготовки.
Учёт специфической активности полуфабриката интерферона осуществляют через 24-48 ч, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50/0,1мл. Учёт результатов проводят в случае отсутствия дегенерации в контрольной культуре. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.
Пересчет активности в МЕ осуществляется по формуле:
Х (МЕ/мл) = титр образца (Ед/мл)
× ------------------------------
Противовирусная активность
полуфабриката интерферона
Контроль токсичности
Полуфабрикат интерферона
должен быть не токсичным. Контроль
проводят на клеточных культурах, которые
используют для определения
В лунки с монослойной культурой вносят по 0,1 мл исследуемых образцов полуфабриката интерферона в разведении 1:50 в питательной среде 199, содержащей 10 % сыворотки крупного рогатого скота и 100 мкг/мл канамицина сульфата либо другого антибиотика. Используют 3 лунки на каждую пробу. В 3 лунки с контрольной культурой вносят питательную среду без препарата.
Культуры выдерживают 48 часов при температуре (37,0±1,0) °С в атмосфере 5 % углекислого газа, влажности (60-70) % , после чего просматривают под микроскопом при 100-кратном увеличении. Клеточный монослой должен быть неповреждённым, без признаков дегенерации, не отличаться от контрольных проб.
При наличии признаков дегенерации в опытных лунках контроль повторяют. В случае повторного появления дегенерации клеток в опытных культурах при отсутствии дегенерации в контрольном монослое препарат бракуют и передают на утилизацию.
Контроль специфической безопасности
Полуфабрикат интерферона не должен содержать живого вируса Сендай или вируса болезни Ньюкасла. Полноту инактивации вируса-индуктора Сендай контролируют с использованием 10-11-дневных куриных эмбрионов. При использовании вируса болезни Ньюкасла контроль проводят двумя методами с использованием 10-11-дневных КЭ и культуры фибробластов куриных эмбрионов.
Контроль на куриных эмбрионах
Для контроля используют 10-11-дневные КЭ, полученные на ТО-4-1. Полуфабрикат интерферона вводят по 0,2 мл в аллатоисную полость 5 куриных эмбрионов. После инкубации в термокомнате в течение 48 ч вируса болезни Ньюкасла и 72 ч вируса Сендай при температуре (37,0±1,0) ºС не должно быть гибели эмбрионов. После вскрытия куриных эмбрионов стягивают аллантоисную жидкость и проверяют в реакции гемагглютинации с использованием 1,0 % взвеси куриных эритроцитов. Для этого в лунки планшетов вносят 3 последовательные двукратные разведения аллантоисной жидкости в 0,5 мл раствора буферного солевого при использоании вируса Сендай или 0,9 % раствора натрия хлорида при использовании вируса Ньюкасла. Затем в каждую лунку добавляют равный объем взвеси куриных эритроцитов. Результаты учитывают через 50-60 мин по оседанию эритроцитов в контроле. Гемагглютинации не должно быть.
При гибели хотя бы одного эмбриона или наличии гемагглютинации контроль повторяют на удвоенном количестве эмбрионов. В случае повторной гибели эмбрионов или выявлении гемагглютинации полуфабрикат передают на стадию ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации. Затем повторяют контроль вирусологической безопасности. При гибели хотя бы одного эмбриона или наличии гемагглютинации полуфабрикат интерферона обеззараживают (ОБО-12).
Контроль на фибробластах куриного эмбриона
Проводят в монослойной культуре клеток, выращенной в пробирках. В пробирки вносят по 1,0 мл полуфабриката интерферона, на каждый образец препарата используют не менее 4 повторов. В 4 пробирки с контрольной культурой клеток вносят питательную среду, которые инкубируют при температуре (37,0±1,0) °С, влажности (60-70) % в течение 72 часов. Учёт производят под микроскопом биологическим при 100-кратном увеличении. Монослой клеток должен оставаться неповреждённым, без признаков цитопатического действия. При наличии дегенерации культуры клеток контроль повторяют. В случае повторного выявления цитопатического действия препарата при нормальной культуре клеток в контрольных пробирках полуфабрикат передают на стадию ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации. Затем повторяют контроль. При наличии цитопатического действия полуфабрикат обеззараживают и утилизируют (ОБО-12).
Контроль на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В (НВsAg)
В полуфабрикате интерферона должен отсутствовать поверхностный антиген вируса гепатита В.
Контроль проводят методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем, разрешенных к применению в практике здравоохранения России, в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциям по применению. Чувствительность метода должна быть не ниже 0,1 нг/мл.
Контроль на клеточных культурах
Используют монослойные перевив
крови крупного рогатого скота (ТУ 8265-0009-01895016-2007, ТУ 9385-007-13175637-2008, ТУ 9385-059-14237183-07, ТУ 9382-009-01895016-07), или сыворотки из крови пищевой КРС (ТУ 10.02.01.174-93) или сыворотки плодов коров жидкой для культур клеток, 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли (ФСП 42-0048-1083-01) или 100 мкг/мл гентамицина (ФСП 42-0358-06, ФСП 42-0048-5841-04) или 100 мкг/мл канамицина (ФСП 42-0054-6503-05 или ФСП 42-0048-6670-05), или 50 ед/мл эритромицина фосфата (ФСП 42-1168-07). Используют не менее
3-х лунок. В лунки
с контрольной культурой
Культуры выдерживают 48 часов при температуре (37±1) °С в атмосфере (5±0,5) % углекислого газа (СО2), влажности (70±5) %, после чего просматривают под микроскопом при увеличении 100х. Клеточный монослой должен оставаться неповреждённым, без признаков дегенерации и не отличаться от контрольных проб.
В случае появления признаков дегенерации в опытных лунках (пробирках) контроль повторяют. При повторном появлении дегенерации клеток в опытных культурах и нормальном монослое в контрольных культурах препарат бракуют.
Контроль на куриных эмбрионах
Препарат вводят по 0,2 мл в аллантоисную полость (не менее 5 эмбрионов при использовании вируса NDV и 10 эмбрионов вируса Сендай). После инкубации в течение 48 ч вируса NDV и 72 ч вируса Сендай при температуре (37±1) °С не должно быть гибели эмбрионов. Стягивают аллантоисную жидкость отдельно от каждого эмбриона и, не объединяя пробы, проверяют в реакции гемагглютинации с 0,5%-1%-ными куриными эритроцитами. Для этого в лунках планшетов готовят 2-3 последовательные двукратные разведения аллантоисной жидкости в
0,5 мл 0,9 % раствора натрия
хлорида при использовании виру
При гибели хотя бы одного эмбриона или наличии гемагглютинации хотя бы в одной пробе, контроль повторяют на удвоенном количестве эмбрионов. В случае повторной гибели эмбрионов или выявлении гемагглютинации препарат бракуют.
При гибели эмбрионов в контроле, весь контроль повторяют вновь.
Контроль специфической безопасности на фибробластах куриных эмбрионов
В связи с отсутствием цитопатического действия вируса Сендай данную операцию для вируса Сендай не проводят.
Проводят в монослойной культуре клеток, выращенной в пробирках или 96-луночных планшетах с плоским дном на питательной среде 199 или Игла-МЕМ, содержащей 5-10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли и 100 мкг/мл гентамицина сульфата или канамицина сульфата, или 50 ед/мл эритромицина. Посевная доза - 4-6 х 104 кл/0,1 мл на лунку и 0,5-1,5 х 106 кл/мл на пробирку. Культуру клеток инкубируют при температуре (37±1) °С в атмосфере (5±0,5) % СО2 при влажности (70±5) %. Монослой клеток формируется через 3-4 суток. Среду сливают и вносят интерферон в разведении 1:5 в питательной среде 199 или Игла-МЕМ по 0,1 мл в лунки планшета или по 1,0 мл в пробирки. На каждый образец препарата используют не менее 4 лунок (пробирок). В 4 лунки (пробирки) с контрольной культурой клеток вносят питательную среду. Учёт контроля проводят под микроскопом при 100-кратном увеличении через 48-72 ч инкубации. Монослой клеток должен оставаться неповреждённым, без признаков цитопатического действия. При наличии дегенерации культуры клеток контроль повторяют. В случае повторного выявления цитопатического действия препарата при нормальной культуре клеток в контрольных лунках (пробирках) препарат бракуют.
Контроль специфической активности
Препарат должен содержать не менее 1000 МЕ противовирусной активности в ампуле.
Определение проводят на диплоидных или перевиваемых линиях клеток, или других чувствительных к интерферону a-типа, в сравнении со стандартным образцом активности человеческого лейкоцитарного интерферона a-типа (ОСО ГИСКа, Международного стандарта ВОЗ или стандартного образца предприятия).
Клетки выращивают во флаконах для культур клеток на питательной среде 199 или Игла-МЕМ, содержащей 5-10 % сыворотки крови крупного рогатого скота, 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли или 100 мкг/мл гентамицина сульфата или канамицина сульфата.
В матрац со сформировавшимся клеточным монослоем вносят (50±5) мл раствора Версена или смеси раствора Версена и раствора трипсина в соотношении 3:1, подогретых до (37±1) °С.
Через 5-8 мин раствор выливают и матрац с набухшими клетками помещают в термостат (37±1) °С на 10-20 мин для отслаивания клеток от стекла. Затем с соблюдением условий асептики в матрац вливают 10 мл питательной среды, клетки ресуспендируют и отбирают пробу для подсчёта.
Взвесь клеток, содержащую (15-25) х 104 кл/мл, вносят по 0,2 мл в лунки 96-луночных планшетов с плоским дном. Культуру клеток в планшетах инкубируют при температуре (37±1) °С в атмосфере, содержащей (5±0,5) % СО2 и (60-70) % влажности. Для определения противовирусной активности интерферона используют планшеты или пробирки со сплошным монослоем клеток.
Для определения активности в ампулу с препаратом вносят 1 мл питательной среды 199 или Игла-МЕМ, содержащей 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли или 100 мкг/мл гентамицина сульфата или канамицина сульфата (в которую при необходимости добавляют 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота). Готовят двукратные разведения (выше и ниже разведения предполагаемого титра активности) исследуемых препаратов и стандарта активности в питательной среде 199 или среде Игла-МЕМ с антибиотиками. На каждое разведение используют не менее 4 лунок планшета. Из лунок удаляют питательную среду и вносят по 0,1 мл приготовленных разведений интерферона. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы индикаторного вируса – вируса везикулярного стоматита (ВСВ). В эти лунки вносят по 0,1 мл питательной среды. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют 24 ч при (37±1) °С в атмосфере (5±0,5) % СО2, и влажности (60-70) %. После этого в каждую лунку с исследуемыми образцами вносят определенную заранее дозу индикаторного вируса, соответствующую 100 ТЦД50/0,1 мл. Осуществляют контроль взятой дозы вируса на предназначенных для этой операции 16 лунках с культурой. Используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД50/0,1мл, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД50/0,1мл, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубируют 24-48 ч при температуре (37±1) °С в атмосфере(5±0,5) % СО2, под контролем дозы вируса.
Определение активности интерферона осуществляют через 24-48 ч, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50/0,1мл.
Учет результатов проводят в случае отсутствия дегенерации в контрольной культуре.
За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок оказалась полностью защищенной от цитопатического действия вируса. Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера.
Пересчет активности в МЕ осуществляется по формуле:
X (ME/мл)=титр образца (Ед/мл) x активность стандарта в МЕ/мл
Противовирусная активность интерферона должна быть не менее 1000 МЕ в ампуле.
Характеристика стандартного образца активности: стандарт предназначен для оценки и
выражения в МЕ (международных единицах) противовирусной активности препарата интерферона при титровании его на культуре клеток по защите от цитопатического действия индикаторного вируса. Стандарт представляет собой интерферон альфа типа. Препарат разлит по 1 мл, лиофилизирован, герметизирован под вакуумом. Препарат представляет собой порошок белого или от светло-желтого до розового цвета, растворимый в воде очищенной в течение 1 минуты. Раствор препарата прозрачен, бесцветен, не содержит видимых примесей. Препарат стерилен, нетоксичен на культуре клеток. Препарат хранят при температуре минус 20 оС.