Получение интерферона

В технологии интерферона  для приготовления рабочих растворов  дезинфицирующих средств, мытья  посуды используют воду очищенную, для  приготовления рабочих растворов, применяемых непосредственно в  технологическом процессе, используют воду для инъекций.

Воду очищенную и воду для инъекций получают на участке водоподготовки.

Воду для инъекций получают из воды очищенной на установке Супер-Q (UCQ-4).

Приготовление рабочих  растворов и питательных сред

На стадии получения  «чистых» лейкоцитов используют следующие  растворы:

- раствор метилцеллюлозы 0,3 % для фракционирования лейкоэритромассы;

- раствор натрия цитрата  50 % в качестве антикоагулянта;

- раствор аммония хлористого 0,83 % для гемолиза оставшихся после  фракционирования эритроцитов;

- раствор трилона Б  5 % в качестве антикоагулянта при проведении гемолиза;

- раствор сахарозы 3 % для добавления в среду для  прайминга.

На стадии биосинтеза используют следующие растворы:

- 20 % раствор соляной  кислоты для нейтрализации вируса;

- 20 % раствор натрия  гидроокиси для подведения рН полуфабриката интерферона.

На стадии стандартизации используют следующие растворы:

- фосфатный буферный  раствор с сахарозой для разведения  полуфабриката интерферона, рН 6,5-6,7;

- 20 % раствор натрия  гидроокиси для подведения рН  раствора интерферона перед розливом;

Все необходимые для  приготовления растворов реактивы поступают в отделение после  прохождения входного контроля в ОКК  и получения  разрешения на использование. Для приготовления растворов используют воду для инъекций.

В процессе получения «чистых» лейкоцитов, на стадии прайминга и биосинтеза используют питательные среды:

- питательная среда  для ресуспендирования лейкоцитов  и биосинтеза (среда № 1);

- питательная среда  для прайминга (среда № 2);

Приготовление питательной среды № 1 (на 1 л)

К среде 199 с помощью градуированных пипеток прибавляют канамицин и 50 % раствора цитрата натрия. Хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют плазмы донорской нормальной карантинизированной. Тщательно перемешивают содержимое емкости путем круговых движений в течение 1-2- минут. Доводят полученный раствор средой 199 до 1 л.

 Приготовление  питательной среды № 2 (на 1л)

К среды 199  с помощью  градуированных пипеток прибавляют канамицин и 50 % раствора цитрата натрия. Хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют плазмы донорской нормальной карантинизированной. Тщательно перемешивают содержимое емкости путем круговых движений в течение 1-2- минут. Затем добавляют 100 мл очищенного полуфабриката интерферона со специфической активностью не менее 2000 МЕ/мл. С помощью разных стерильных пипеток с грушей добавляют инсулин в разведении 1:100, 3 % раствор сахарозы и 1 мл вируса Сендай. Доводят полученный раствор средой 199 до 1 л.

Получение вируса-индуктора.

В качестве индуктора интерфероногенеза используют штамм вируса Сендай, полученный из Государственной коллекции вирусов (ГКВ) ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, которые поддерживают в пассажах на куриных эмбрионах. Возраст куриных эмбрионов (КЭ) при использовании вируса Сендай 10-11 суток.

Куриные яйца весом (60±10) г получают от здоровых кур из благополучных  в эпизоотическом отношении птицеводческих хозяйств. Сортировку осуществляют в затемненной комнате при помощи овоскопа. Яйцо инкубируют при температуре (37,0±1,0) ºС и влажности (40-60) % в течение 9-11суток. Развившиеся КЭ должны иметь хорошо развитую кровеносную сеть, четко выраженную воздушную полость, не иметь трещин. Неоплодотворенные яйца и погибшие эмбрионы отбраковывают. Первое заражение (пассаж) КЭ осуществляют лиофилизированным штаммом вируса Сендай или рабочим посевным  материалом. Содержимое ампулы вируса Сендай растворяют в 1 мл раствора буферного солевого, готовят  ряд десятикратных разведений вируса  (10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4) на растворе буферном солевом.  Для заражения КЭ используют  разведения 10^-2, 10^-3 или 10^-4,  шприцы на 1 мл с иглами из нержавеющей стали длиной 20 мм. В центре тупого конца яйца  делают отверстие буравчиком. Иглу вводят в отверстие яичной скорлупы на глубину ¾ ее длины. Материал вводят в аллантоисную полость куриного эмбриона в объеме 0,2 мл. После заражения отверстие в скорлупе заливают стерильным расплавленным над пламенем спиртовки парафином. Зараженные КЭ передают в термокомнату для инкубации  при температуре (37,0±1,0) °С, влажности (40-60) % на 72 часа. Зараженные развившиеся КЭ на лотках помещают в холодильный шкаф и охлаждают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18 часов. В боксе скорлупу у пламени спиртовки вскрывают стерильными ножницами со стороны воздушной полости, визуально оценивают жизнеспособность КЭ. Из жизнеспособных КЭ  стягивают вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ) пастеровской пипеткой с грушей в стерильные флаконы. Бутылки помещают в холодильник для осаждения эритроцитов, кусочков ткани КЭ. Затем центрифугируют 20 минут со скоростью (1300±100) об/мин, при температуре в камере центрифуги (6±2) °С. Надосадочную жидкость декантируют в стерильные бутылки. При работе с вирусом Сендай ВАЖ 1 пассажа используют для последующего заражения КЭ.  Данное количество ВАЖ используют для проведения контролей полученной вируссодержащей аллантоисной жидкости (стерильность, гемагглютинирующая активность) и для проведения  нескольких последовательных операций заражения КЭ вирусом Сендай на 2 пассаж, а со второго - на третий. На каждое заражение используют только часть ВАЖ, остальной объем хранят до  6 месяцев при температуре от 2 до 8 °С.  

Получение 2 и 3-го пассажа вируса Сендай и контроль ВАЖ

Последующие заражения КЭ осуществляют ВАЖ 1 (2) пассажа.  Для этого готовят  разведения ВАЖ с использованием раствора буферного солевого до рабочего (10^-2, 10^-3 или 10^-4), которые используют для заражения КЭ.

Процесс проводят аналогично получению  ВАЖ 1-го пассажа. 

Контроль вируссодержащей  аллантоисной жидкости

Для контролей из каждого  флакона с полученной ВАЖ пипеткой отбирают пробы в объеме  10 мл.  ВАЖ контролируют на стерильность, гемагглютинирующую активность (реакция РГА). ВАЖ должна быть стерильной, гемагглютинирующий титр вируса-индуктора Сендай должен быть не ниже 1:16000 ГАЕ/мл.

Получение «чистых» лейкоцитов и их праймирование

Получение лейкоэритромассы

 Сырьем для получения  лейкоцитов служит донорская  кровь. Забор крови осуществляют в стерильные гемаконы. Одновременно отбирают пробы крови в пробирки для исследования на маркеры гемотрансмиссивных инфекций. Образцы крови доноров проверяют в лаборатории донорского пункта на отсутствие инфицирования сифилисом,  поверхностного антигена вируса гепатита В, антител к вирусу гепатита С, на отсутствие антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1,ВИЧ-2).

Фракционирование лейкоэритромассы.

В отделение интерферона  гемаконы с лейкоэритромассой (далее - ЛЭМ) поступают из донорского пункта не позднее, чем через 24 часа после забора крови. В качестве осадителя эритроцитов используют раствор метилцеллюлозы  0,3 %. Соотношение объемов раствора метилцеллюлозы и  лейкоэритромассы должно быть  1:1 (±2% по объему МЦ или ЛЭМ). В качестве антикоагулянта используют раствор натрия цитрата 50 %. В полученный раствор сливают всю лейкоэритромассу из гемаконов, тщательно перемешивают содержимое бутыли круговыми движениями через каждые добавленные 3-4 гемакона. После наполнения емкость  закрывают резиновой пробкой и оставляют при  комнатной температуре на 40–50 минут. По истечению указанного времени содержимое бутыли расслаивается на 3 слоя: верхний слой светлый – раствор метилцеллюлозы со взвешенными в нем лейкоцитами; средний – пленка лейкоцитов на поверхности эритромассы и нижний темный слой – эритромасса (раствор метилцеллюлозы со взвешенными в нем эритроцитами). По истечению указанного времени через систему сифонов с помощью вакуума сливают в стерильную емкость верхний слой и часть среднего слоя.

Выделение  и подсчет «чистых» лейкоцитов

Взвесь лейкоцитов с  примесью эритроцитов через систему  сифонов с помощью сжатого воздуха разливают в стерильные бутылки вместимостью, закрывают резиновыми пробками и центрифугируют 20 минут со скоростью (1300±100) об/мин., при температуре в камере центрифуги (6±2) С°. После центрифугирования  надосадочную жидкость сливают в емкость и передают для обеззараживания. К полученным осадкам в каждую бутылку пипеткой добавляют  среду  № 1, энергично встряхивают и объединяют в бутылки на 450 мл по 50 мл,  в качестве антикоагулянта пипеткой добавляют  5 % раствора трилона Б.  Для проведения остаточного гемолиза эритроцитов, используют раствор аммония хлористого 0,83 %. К содержимому бутылок добавляют раствор аммония хлористого до 450 мл в каждую, затем бутылки закрывают пробками и помещают в холодильник при температуре от 2 до 8 °С на 10 минут. Содержимое бутылок чернеет после гемолиза оставшихся эритроцитов. Бутылки с гемолизированными эритроцитами центрифугируют 15  минут со скоростью  (1300 ± 100) об/мин, при температуре в камере центрифуг  (6±2) °С .

После центрифугирования  надосадочную темную  жидкость сливают в емкость и обеззараживают. К осадкам («чистые» лейкоциты) добавляют среду № 1, энергично встряхивают и объединяют в одну емкость, доводят объем до 1 литра средой № 1 и отбирают пробу 1 мл стерильной пипеткой в пенициллиновый флакон с соблюдением условий стерильности для подсчета лейкоцитов.Заправляют камеру Горяева для подсчета форменных элементов крови. Подсчет лейкоцитов проводят во всей камере с помощью микроскопа лабораторного.

Учитывая количество лейкоцитов в норме в крови  здорового донора, от 100  доноров получают в среднем 100  млрд. лейкоцитов.

Праймирование лейкоцитов в бутылях

Для прайминга используют среду № 2, из расчета 1 л среды на 18-22 млрд. лейкоцитов. Праймирование лейкоцитов  можно  проводить в емкости вместимостью 10-15 л. Соотношение взвеси лейкоцитов и воздуха не менее, чем 1:2. Емкость со взвесью лейкоцитов ставят в водяную баню. Температура воды в водяной бане (37,0±1,0) °С.  Время инкубации 2 часа 30 минут. Перемешивание проводят вручную через каждые 5 минут.

 

 

Индукция лейкоцитов

Введение вируса-индуктора Сендай. По окончании прайминга во взвесь лейкоцитов в асептических условиях добавляют ВАЖ через систему сифонов.

При использовании вируса Сендай в качестве интерфероногена  рассчитывают дозу вируса от 30 до 150 (среднее ≈ 80) ГАЕ на 1 млн. лейкоцитов.  Время индукции 1 час 30 минут при температуре (37,0±1,0) °С. Перемешивание проводят вращательными движениями вручную через каждые 5 минут.

Отделение индуцированных лейкоцитов

По окончании индукции взвесь индуцированных лейкоцитов при помощи сжатого воздуха через систему сифонов из емкости и разливают в бутылки по 450 мл. Бутылки центрифугируют 20 минут со скоростью (1300±100) об/мин, при температуре в камере центрифуги  20-25  °С . После центрифугирования  надосадочную жидкость (отход) стягивают с помощью вакуума в бутыль для последующего обеззараживания.

К осадку индуцированных лейкоцитов в бутылках добавляют  по 20-30 мл питательной среды № 1, энергично  встряхивают, объединяют в 1 бутылку  и доводят объем питательной средой № 1 до 0,5 л.

Биосинтез интерферона

Биосинтез интерферона  проводят  в емкостях на роллерной  установке, которая находится в  термокомнате участка биосинтеза.

Нагрузка лейкоцитов на стадии биосинтеза должна быть в  пределах от 3,9х10⁹  до  4,5х10⁹ в  1 л;  (4,0х10⁹)/л. Рассчитывают необходимое количество питательной среды № 1.

Индуцированную взвесь лейкоцитов тщательно перемешивают и равномерно вносят в емкости  с питательной средой № 1. Устанавливают  под наклоном на роллеры в термокомнате так, чтобы не заливало пробку, включают роллерную установку. Емкости  вращаются со скоростью 12 об/мин. Лейкоциты равномерно перемешиваются, синтезируя при этом интерферон. Процесс биосинтеза протекает в течение 18-20 часов при температуре (37,0±1,0) ºС.

 По завершению процесса биосинтеза роллерную установку выключают. Содержимое емкостей с помощью сжатого воздуха через систему стерильных сифонов разливают в стерильные бутылки вместимостью 0,45 л.

Бутылки закрывают  и  центрифугируют 20 минут со скоростью (1300±100) об/мин, при температуре в камере центрифуги (6±2) °С. После центрифугирования надосадочную жидкость (полуфабрикат интерферона) перетягивают с помощью вакуума через систему сифонов в стерильные бутыли. Для проведения испытаний полученного полуфабриката на стерильность используют метод прямого посева.  На время проведения контролей посевы помещают в термостаты (Т-41, Т-42) при температурах (20-25) ºС и (30-35) ºС  соответственно.

Инактивация вируса-индуктора

Сразу после проведения посева на стерильность, рН в емкостях доводят до значения (2,2±0,2) постепенным добавлением при постоянном перемешивании 20 % раствора кислоты соляной. После тщательного перемешивания содержимого емкости стерильной пипеткой вместимостью 10 мл отбирают пробу в количестве 10 мл и измеряют рН.

Нейтрализация вируса-индуктора  и возможных вирусов контаминантов  происходит при экспозиции в течение не менее 5 дней при кислом значении рН (2,2±0,2).

Очистка полуфабриката  интерферона и его контроль

Полуфабрикат интерферона фильтруют  в 3 этапа:

- осветляющая фильтрация с использованием  разовых фильтрующих материалов;

- ультрафильтрация (очистка от  возможных вирусов-контаминантов)  с использованием установки «Сартокон-мини»  с мембранами на основе ацетатцеллюлозы  или полисульфонамида, или полиэфирсульфона предел задержания 300 кДа;

- стерилизующая фильтрация с  использованием  мембран с размерами  пор 0,22 мкм.

После стерилизующей  фильтрации с помощью пипетки  вместимостью 10 мл проводят отбор проб из каждой емкости с полуфабрикатом интерферона в количестве 10 мл в стерильные флаконы: 4 мл для контроля стерильности (1 флакон), 3 флакона по 2 мл для контроля специфической активности и токсичности; специфической безопасности; отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В.

Контроль полуфабриката интерферона

Полуфабрикат интерферона контролируют по следующим показателям: стерильность, специфическая активность, аномальная токсичность, специфическая безопасность, отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В.

Контроль специфической  активности полуфабриката интерферона

Для определения активности полуфабриката интерферона готовят  двукратные разведения (до разведения, близкого к предполагаемому титру  активности) исследуемого образца полуфабриката  интерферона и стандартного образца  активности (ОСО ГИСКа, Международного стандарта ВОЗ или стандартного образца предприятия) в питательной среде 199, содержащей 100 ед/мл бензилпенициллина натриевой соли и 100мкг/мл гентамицина, или 100 мкг/мл канамицина сульфата, или 50 ед/мл эритромицина фосфата. На каждое разведение используют 4 лунки. Из лунок планшетов со сформированным монослоем клеток  удаляют питательную среду и вносят по 0,1 мл приготовленных разведений интерферона. Либо во все лунки планшета вносят питательную среду по 0,1 мл, в первые лунки (согласно протоколу титрации) вносят приготовленное первое разведение и готовят последовательные разведения по И-1997. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контроля клеточной ткани. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы вируса-индикатора, в которые вносят по 0,1 мл питательной среды. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубируют 24 ч при (37,0±1,0) °С в атмосфере 5 % СО₂, затем в каждую лунку с исследуемыми образцами вносят определенную дозу вируса везикулярного стоматита, соответствующую 100 ТЦД₅₀/0,1 мл. Контроль взятой дозы вируса осуществляют на предназначенных для этой операции 16 лунках с монослоем - по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД₅₀/0,1мл, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД₅₀/0,1мл, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы, культуру клеток инкубируют 24-48 ч при температуре (37,0±1,0) °С в атмосфере 5 % СО₂.