Масс спектрометрический метод анализа

Было разработано несколько теорий для объяснения десорбции посредством MALDI. Модель термических пиков предполагает, что выброс неповреждённых молекул обусловлен слабым колебательным взаимодействием между матрицей и аналитом, что минимизирует перенос колебательной энергии от матрицы к модам молекул аналита, тем самым минимизируя фрагментацию. Теория импульсного давления предполагает, что создаётся градиент давления, перпендикулярный поверхности, и десорбция больших молекул вызвана передачей импульса при их столкновениях с быстро движущимися молекулами матрицы. Обычно считается, что ионизация происходит посредством передачи протона или катионизации во время процесса десорбции.

Полезность MALDI для анализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молекулярном весе неповреждённых молекул. Способность давать точную информацию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белков. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализом масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же ферментативным воздействием на образец).[4]

Таблица 1.4. Преимущества и недостатки метода лазернойдесорбции/ионизации при помощи матрицы (MALDI).

Преимущества Недостатки   практический диапазон масс до 300000 Da. Экземпляры со значительно большей массой наблюдались при помощи детектора высокого тока; обычная чувствительность порядка нескольких фемтомоль или даже пикомоля. Возможна чувствительность до аттомоля; мягкая ионизация с малой фрагментацией; нечувствителен к солям в концентрациях до миллимолярных; удобен для анализа сложных смесей фон матрицы, который может быть проблемой для соединений с массой ниже 700 дальтон. Помехи этого фона сильно зависят от материала матрицы; возможнофоторазложение при лазерной десорбции/ионизации; кислотные матрицы, используемые в MALDI могут вызывать разложение некоторых соединений

 

 

Приготовление образца и матрицы оказывает значительное влияние на качество масс-спектров MALDI белков и пептидов (рис. 1.15). Среди большого разнообразия известных методов приготовления наиболее часто употребляемым является метод высушенной капли. В этом случае насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота (0.5-2.0 мкл) такой смеси затем помещается на место образца, где затем высушивается. Ниже приведена методика такого приготовления:

отобрать пипеткой 0.5 мкл образца на подложку;

отобрать пипеткой 0.5 мкл матрицы на подложку;

перемешать образец и матрицу втягиванием их в пипетку и выпусканием;

позволить высохнуть на воздухе.

Для пептидов, небольших белков и большинства других соединений: насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с 0.1% ТФА.

Для белков и других тяжёлых молекул: насыщенный раствор синапиновой кислоты в 50:50 ацетонитрил:вода с добавлением 0.1% ТФА.

Для гликопептидов/белков и маленьких соединений: насыщенный раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) в 50:50 ацетонитрил:вода.

Рис. 1.15. Обычно используемые в MALDI матрицы и подложка для MALDI с показанным расположением матрицы. Одним из преимуществ MALDI является то, что множество образцов может быть подготовлено в одно и то же время, как видно по этой многообразцовой подложке.

 

 

Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «плёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ей. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения. Аналогично, в толстослойном методе нитроцеллюлоза (NC) используется как добавка к матрице. После образования единого слоя NC-матрица на цели добавляется образец. Этот метод приготовления предотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чувствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагированных из гелей. Сэндвичевый метод – другой вариант в этой категории. Тонкий слой кристаллов матрицы приготовляется как в тонкослойном методе, затем последовательно добавляются капли (a) водного 0.1% ТФА, (b) образца и (c) матрицы.

Десорбция/ионизация на кремнии (DIOS)

 

DIOS – свободный от матрицы  метод, который использует импульсную  десорбцию/ионизацию на кремнии (рис. 1.16). Поверхности структурированного кремния, такого, как пористый кремний или кремниевое нановолокно являются УФ-поглощающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м2/см3). При применения в масс-спектрометрии с лазерной десорбцией/ионизацией, строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообразия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соединения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него.

DIOS сильно связан с MALDI. Оборудование для DIOS-MS требует только  незначительной настройки для  использования в MALDI; чип просто  закрепляется на обработанной MALDI-подложке  и вставляется в масс-спектрометр. Та же длина волны лазера (337 НМ),

обычно применяемая в MALDI, подходит и для DIOS. Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у него есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низкий фон на малых диапазонах массы, такое же размещение водных образцов, упрощённая подготовка образцов. Вдобавок, компоновка в чипах легко адаптируется к автоматической подготовке образца, при которой лазер быстро обрабатывает чип, переходя от одного участка к другому. DIOS может, таким образом, ускорить и упростить крупные анализы соединений с низкой молекулярной массой, так же, как MALDI для макромолекул. Так как массы многих низкомолекулярных соединений могут быть легко измерены, DIOS-MS применим для анализа превращений малых молекул, как ферментативных, так и химических. [3]

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами (FAB)

 

 

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, схожий с MALDI, так как в нём используется матрица и пучок высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Важно, однако, обозначить различия между MALDI и FAB. В MALDI, энергетический пучок представляет собой импульсный лазерный свет, в то время как FAB использует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. Также нужно отметить, что FAB примерно в 1000 раз менее чувствителен, нежели MALDI.

Бомбардировка быстрыми атомами – мягкий способ ионизации, который требует прямого введения зонда для подачи образца и пучок нейтральных атомов Xe или ионов Cs+ для распыления образца и матрицы с поверхности зонда для подачи. Обычно в FAB спектре обнаруживаются ионы матрицы, наряду с протонированными или катионизированными (например, M+Na+) молекулярными ионами аналита.

Матрица FAB. Способствующая процессам десорбции и ионизации, матрица FAB – нелетучая жидкость, которая служит, чтобы постоянно восполнять поверхность новым образцом по мере того, как он бомбардируется пучком ионов. Поглощая большую часть падающей энергии, матрица также минимизирует разложение образца из-за высокоэнергетических частиц образца.

 

 

 
Две наиболее часто употребляющихся матрицы для FAB –

 

м-нитробензиловый спирт и глицерин.

Быстрые атомы или ионы сталкиваются с матрицей, вынуждая матрицу и аналитдесорбироваться в газовую фазу. Образец может быть уже заряженным и только потом быть переведённым в газовую фазу, или же может стать заряженным в ходе десорбции посредством FAB посредством реакций с окружающими молекулами или ионами. Оказавшись в газовой фазе, заряженные молекулы могут быть электростатически перемещены в масс-анализатор. [1]

Электронная ионизация (EI)

 

 
Электронная ионизация – один из наиболее важных способов ионизации для повседневных анализов малых гидрофобных термически стабильных молекул и до сих пор широко используется. Так как EI обычно даёт большое число фрагментарных ионов, это «жёсткий» способ ионизации. Однако, фрагментарная информация также может быть очень полезной. Например, используя базы данных, содержащие свыше 200000 масс-спектров электронной ионизации, возможно определить неизвестное соединение в течение нескольких секунд (конечно, если оно есть в базе данных). Эти базы данных, а также объём памяти и поисковые алгоритмы современных компьютеров позволяет быстро просматривать такие базы (как, например, база NIST), таким образом значительно облегчая идентификацию малых молекул.

Устройство электронной ионизации прямолинейно (рис. 1.18). Образец должен поставляться в газообразной форме, что осуществляется «выкипанием» образца посредством термической десорбции или введением газа через капилляр. Капилляр часто является выходом капиллярной колонки прибора газовой хроматографии. В этом случае капиллярная колонка обеспечивает разделение (это также известно как газовая хромат-масс-спектрометрия – GC/MS). Десорбция твердых или жидких образцов производится нагреванием в вакууме масс-спектрометра. После перехода в газовую фазу соединения переносятся в устройство электронной ионизации, где электроны возбуждают молекулу, тем самым вызывая ионизацию отрывом электрона и фрагментацию.

Применимость электронной ионизации значительно уменьшается для соединений с молекулярной массой свыше 400 дальтон, потому что необходимая термическая десорбция образца ведёт к температурному разложению до того, как происходит испарение. Принципиальными проблемами, связанными с термической десорбцией при электронной ионизации являются 1) нелетучесть больших молекул, 2) термическое разложение, 3) избыточная фрагментация.

Механизм отрыва электрона при образовании положительного иона осуществляется следующим образом:

Образец термически испаряется.

Электроны испускаются нагретым катодом и ускоряются электрическим полем с разностью потенциалов в 70 В, чтобы образовать непрерывный пучок электронов.

Молекулы образца проходят через пучок электронов.

Электроны с кинетической энергией 70 эВ передают часть своей энергии молекулам. Эта передача вызывают ионизацию (отрыв электрона) так, что ион сохраняет обычно не более 6 эВ избыточной энергии.

Избыток внутренней энергии (6 эВ) в молекуле ведёт к некоторой фрагментации.Электронный захват обычно намного менее эффективен, чем отрыв электрона, хотя иногда используется таким же способом, с высокой чувствительностью работая для соединений с большим сродством к электрону: M + e- → M-. [1]

Химическая ионизация (CI)

Химическая ионизация (CI) применяется к образцам, сходным с анализируемыми при помощи EI, и обычно применяется, чтобы увеличить долю молекулярного иона. Химическая ионизация использует газофазные ионно-молекулярные реакции в вакууме масс-спектрометра для получения ионов из молекул образца. Процесс химической ионизации инициируется газом-реагентом, таким, как метан, изобутан или аммиак, который ионизируется электронным ударом. Высокое давление газа в устройстве ионизации приводит к ионно-молекулярным реакциям между ионами газа-реагента и его нейтральными молекулами. Некоторые продукты ионно-молекулярных реакций могут реагировать с аналитом с образованием ионов.

Возможные механизмы ионизации при CI:

Реагент (R) + e- → R+ + 2 e-

R+ + RH → RH+ + R

RH+ + Аналит (A) → AH+ + R

В отличие от EI, аналит с большей вероятностью образует молекулярный ион с меньшей фрагментацией при использовании CI. Однако, аналогично EI, образцы должны быть термически стабильными, так как испарение в CI-устройстве осуществляется при помощи нагревания.

Отрицательная химическая ионизация (NCI) обычно требует от аналита содержания остатков (например, атомов фтора или нитробензильных групп). Некоторые функциональные группы значительно увеличивают чувствительность NCI, в некоторых случаях от 100 до 1000 раз по сравнению с электронной ионизацией (EI). NCI, возможно, – один из самых чувствительных способов и применяется ко большому разнообразию низкомолекулярных соединений с единственным ограничением, что молекулы часто химически модифицируются с добавлением групп, отвечающих за захват электрона.

 

 

Хотя большинство соединение не образует отрицательных ионов при использовании EI или CI, многие важные соединения могут давать отрицательные ионы, и, в некоторых случаях, отрицательная EI или CI масс-спектрометрия является более чувствительной и избирательной, нежели анализ положительных ионов. Например, такие соединения, как стероиды модифицируются (рис. 1.19), чтобы усилить NCI.

Как было отмечено, отрицательные ионы могут быть получены при электронном захвате, и при отрицательной химической ионизации буферный газ (такой как метан) может замедлить электроны в электронном пучке, позволяя им быть захваченными молекулами аналита. Буферный газ также стабилизирует возбуждённые анионы и уменьшает фрагментацию. Поэтому NCI, в сущности, есть процесс электронного захвата, а не то, что обычно подразумевается под процессом «химической ионизации».[1]

Таблица 1.5. Сравнение основных характеристик способов ионизации.

 

Способ ионизации	Обычный диапазон масс (Da)	Влияние матрицы	Разложение	Сложные смеси	Совместимость с ЖХ	Чувствительность
Ионизация электроспрея (ESI)	70000	Нет	Нет	Несколько ограничено	Превосходно	От многих фемтомоль до нескольких пикомоль
Комментарии	Превосходно для совмещения ЖХ и МС; устойчивость к небольшим концентрация солей (до нескольких мМ); многократная зарядка полезна, но значительно подавлена в случае смесей; низкая устойчивость к смесям; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов).
NanoESI	70000	Нет	Нет	Несколько ограничено, но лучше, чем ESI	Возможно, но обеспечение низкой скорости потока может составить проблему	От многих зептомоль до нескольких фемтомоль
Комментарии	Очень чувствителен и очень малые скорости потока; применим для ЖХ/МС, но малые скорости потока требуют специальных систем; умеренная устойчивость к солям (до нескольких мМ); многократная зарядка полезна, но может быть подавлена в случае смесей; умеренно применим для смесей; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов).
APCI	1200	Нет	Термическое разложение	Несколько применимо	Превосходно	Многие фемтомоли
Комментарии	Превосходно для совмещения ЖХ и МС; малая устойчивость к солям (до нескольких мМ); применимо к гидрофобным образцами
APPI	1200	Нет	Фотодиссоциация	Применимо	Превосходно	Многие фемтомоли
Комментарии	Превосходно для совмещения ЖХ и МС; малая устойчивость к солям (до нескольких мМ); применимо к гидрофобным образцами
MALDI	300000	Есть	Фоторазложение и реакции с матрицей	Хорошо для сложных смесей	Возможно	От нескольких до многих фемтомолей
Комментарии	Несколько устойчиво к солям; превосходная чувствительность; фон матрицы может быть проблемой для ионов с малой массой; мягкая ионизация (наблюдается мало фрагментов); возможно фоторазложение; применимо к сложным смесям. Многократная зарядка весьма ограничена, так что данные не соотносятся с некоторыми другими способами.
DIOS	3000	Нет	Фоторазложение	Хорошо для сложных смесей	Возможно	От нескольких фемтомоль до многих иоктомоль
Комментарии	Несколько устойчиво к солям; отличная чувствительность; мягкая ионизация; фоторазложение возможно; применимо к сложным смесям и низкомолекулярным соединениям
FAB	7000	Есть	Реакции с матрицей и некоторое термическое разложение	Несколько применимо	Очень ограничено	Наномоль
Комментарии	Относительно слабочувствителен; малая фрагментация; мягкая ионизация; высокая устойчивость к солям – до 0,01 М; необходима растворимость в матрице
Электронная ионизация (EI)	500	Нет	Термическое разложение	Ограничено, если не используется ГХ/МС	Очень ограничено	Пикомоль
Комментарии	Хорошая чувствительность; уникальные данные по фрагментации с возможностью просмотра по базам данных; термическое разложение – основная проблема для биомолекул и других высокомолекулярных соединений
Химическая ионизация (CI)	500	Нет	Термическое разложение	Ограничено, если не используется ГХ/МС	Очень ограничено	Пикомоль
Комментарии	Более мягкий подход к ионизации по сравнению с EI, но всё равно с термическим разложением; отрицательная CI особенно чувствителен к перфторированным производным; ограниченный, но мощный подход к некоторым модифицированным молекулам, таким как стероиды.