Масс спектрометрический метод анализа

 

 
Ионизация электроспрея – метод, который обычно применяется для пептидов, белков, углеводов, малых олигонуклеотидов, синтетических полимеров и липидов. ESI производит газообразные заряженные молекулы прямо из жидкого раствора. Ионизация происходит при создании тонкого спрея сильно заряженных капель в присутствии электрического поля. Образец раствора распыляется из области с сильным электрическим полем на конце металлической форсунки, поддерживаемой при потенциале между 700 и 5000 В. Форсунка (или игла), к которой приложен потенциал, служит для распыления раствора в тонкий спрей заряженных капель. Использование сухого газа, нагревания или оба этих способов применяется к заряженным каплям при атмосферном давлении для испарения из них растворителя. С уменьшением размера капель возрастает плотность заряда на их поверхности. Взаимное кулоновское отталкивание между одинаковыми зарядами на этой поверхности становится настолько велико, что превосходит силы поверхностного натяжения и ионы вырываются из капли через «конус Тейлора» - рис. 1.5. Другая возможность состоит в том, что капля взорвётся, высвобождая ионы. В любом случае свободные ионы направляются в канал через электростатические «линзы», направляясь в вакуум масс-анализатора. Так как ESI включает в себя непрерывную подачу раствора, он применим для использования совместно с ВЭЖХ или капиллярным электрофорезом.[4]

 

 
Ионизация электроспрея благоприятствует образованию единично заряженных малых молекул, но также хорошо известно образование в ходе неё многократно заряженных экземпляров больших молекул. Это важное явление, т.к. масс-спектрометр измеряет отношение массы к заряду (m/z) и поэтому многократная зарядка делает возможным наблюдать очень большие молекулы при помощи инструмента с относительно малым диапазоном масс. К счастью, программы, пригодные для всех масс-спектрометров с электроспреем, позволяют произвести вычисления молекулярной массы, необходимые для определения действительной массы многозарядных образцов. Рис. 1.6 и 1.7 показывают различные заряженные состояния двух различных белков, где каждый пик в масс-спектрах может быть соотнесён с различными зарядовыми состояниями молекулярного иона. Многократная зарядка имеет другие важные преимущества в тандемной масс-спектрометрии. Одно из преимуществ состоит в том, что после фрагментации вы наблюдаете больше фрагментарных ионов от многозарядного предшественника, чем от однозарядного.

 

 
Многократная зарядка: белок с массой 10000 дальтон и его теоретический масс-спектр с зарядами до +5 показаны на рис. 1.8. Масса белка остаётся такой же в то время, как отношение m/z меняется в зависимости от числа зарядов на белке. Ионизация белка есть обычно результат протонирования, что не только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных протонов. Это действие на m/z применимо одинаково для любого механизма ионизации молекулы, образовавшего положительно или отрицательно заряженный молекулярный ион, включая присоединение или отрыв несущих заряд частиц, отличных от протона (например, Na+ и Cs+). Многократные положительные заряды наблюдаются для белков, в то время как для олигонуклеотидов типично образование отрицательных зарядов (с ESI).

 

 
Хотя масс-спектрометры электроспрея снабжены программами, которые подсчитывают молекулярный вес, понимание, как компьютер производит эти вычисления для многократно-заряженных ионов полезно. Уравнения 1.1 – 1.5 и рис. 1.9 представляют простое объяснение, где мы принимаем, что пики p1 и p2 являются соседними и различаются одним зарядом, что эквивалентно добавлению одного протона.

 

p = m/z  p1 = (Mr + z1)/z1  p2 = {Mr + (z1 - 1)}/(z1 - 1)	(1.1)  (1.2)  (1.3)
p – пик в масс-спектре  m – общая масса иона z – полный заряд  Mr – средняя масса белка	p1 – значение m/z для p1  p2 – значение m/z для p2  z1 – заряд для пика p1
Уравнения 1.2. и 1.3. могут быть решены для двух неизвестных, Mr и z1. Для пиков в масс-спектре миоглобина, показанном на рис. 1.9, p1=1542, p2=1696.
1542 z1 = Mr + z1  1696 (z1 - 1) = Mr + (z1 - 1)  Решив два уравнения, находим: Mr = 16,951 Da  для z1 = 11	(1.4)  (1.5)

 

 

Растворители для электроспрея

Многие растворители могут быть использованы в ESI и выбираются в зависимости от растворимости исследуемых соединений, летучести растворителя и способности растворителя к отдаче протона. Обычно, основными являются протонные растворители, такие, как, метанол, 50/50 метанол/вода или 50/50 ацетонитрил/вода, в то время как апротонныесорастоврители, такие, как 10% ДМСО в воде, а также изопропиловый спирт, используются, чтобы улучшить растворимость для некоторых соединений. Хотя 100% вода и используется в ESI, её относительно низкое давление пара является определяющим фактором чувствительности; лучшая чувствительность получается при добавлении летучего органического растворителя. Некоторые соединения требуют использования чистого хлороформа с добавлением 0.1% муравьиной кислоты для обеспечения ионизации. Такой подход, хоть и менее чувствительный, может быть эффективен для соединений, не растворимых другим образом.[5]

Буферы, такие, как Na+, K+, фосфат и соли представляют проблему для ESI из-за снижения давления пара капель, ведущего к ослаблению сигнала из-за увеличения поверхностного натяжения капель, ведущего к уменьшению летучести. Поэтому летучие буферы, такие, как ацетат аммония, могут быть использованы более эффективно.[6]

Таблица 1.3. Преимущества и недостатки ионизации электроспрея (ESI)

Преимущества Недостатки практический диапазон масс до 70000 дальтон хорошая чувствительность от фемтомоль до нескольких пикомоль обычно самый мягкий метод ионизации, способный генерировать нековалентные комплексы в газовой фазе легко адаптируется к жидкостной хроматографии легко адаптируется к тандемным масс-анализаторам, таким, как ионные ловушки и тройные квадрупольные инструменты многократная зарядка позволяет производить анализ ионов с высокой массой на приборах с относительно низким m/z диапазоном. нет помех от матрицы присутствие солей и веществ, образующих ионные пары, как, например, ТФА может уменьшить чувствительность сложные смеси могут уменьшить чувствительность одновременный анализ смеси может быть неудовлетворительным многократная зарядка может быть запутанной, особенно при анализе смесей важна чистота образца перенос от образца к образцу

 

 

Устройство прибора ионизации электроспрея

 

Неосевая конфигурация ESI, которая сейчас используется во многих приборах для введения ионов в анализатор (как показано на рис. 1.10), показала себя очень эффективной при использовании с большим потоком жидкости. Основное преимущество такой конфигурации состоит в том, что скорость потока может быть увеличена без засорения или закупоривания входного отверстия. Неосевое распыление важно, потому что вход в анализатор более не насыщается растворителем, тем самым предохраняя капли от попадания во входное отверстие и его загрязнения. Наоборот, только ионы направляются ко входу. Это делает ESI ещё более совместимым с ЖХ при скоростях до мл/мин.

Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI)

 

 
Электроспрей низкого потока, впервые описанный Вильмом и Манном, называли наноэлектроспреем, наноспреем и микроэлектроспреем. Такой способ ионизации является вариацией ESI, в которой игла спрея сделана очень

маленькой и расположена близко ко входу в масс-анализатор (рис. 1.11). Конечным результатом такой простой корректировки становится увеличение эффективности, которое включает уменьшение необходимого количества образца.

Скорости потока для nanoESI обычно составляют ль десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также, источники расположены очень близко ко входу в масс-анализатор, поэтому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен. Например, анализ 5 mM раствора пептида при помощи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50 фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5 пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI (рис. 1.11.), необходимое для образования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим примесям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентрироваться так сильно, как при ESI.[7]

 

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)

 

 
APCI также стала важным способом  ионизации, потому что она генерирует  ионы непосредственно из раствора  и способна к анализу относительно  неполярных соединений. Так же, как  и в электроспрее, поток жидкости для APCI (рис. 1.12) вытекает непосредственно в устройство ионизации.

 

Однако сходство здесь заканчивается. Капли не заряжаются и APCI устройство содержите нагретый испаритель, который обеспечивает быстрое разделение/испарение капель. Молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении.

В APCI ионизация возникает из-за возбуждения/ионизации растворителя коронным разрядом. Т.к. ионы растворителя существуют при атмосферном давлении, химическая ионизация молекул аналита очень эффективна; при атмосферном давлении молекулы аналита сталкиваются с ионами реагента очень часто. Перенос протона (для реакций протонирования MH+) образует положительные ионы, а перенос электрона или отщепление протона ([M-H]-) даёт отрицательные. Сглаживающее влияние сольватных оболочек на ионах реагента и высокое давление газа уменьшают фрагментацию во время ионизации и ведут к образованию практически только нетронутых молекулярных ионов. Многократная зарядка обычно не наблюдается, скорее всего, потому что процесс ионизации более энергичен, чем при ESI.[8]

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)

 

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) стала сейчас важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с относительно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и APCI, поток жидкости для APPI (рис. 1.13) вводится прямо в устройство ионизации.

Основное различие между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец проходит через ультрафиолетовый свет (обычная криптоновая лампа испускает от 10.0 эВ до 10.6 эВ). Часто APPI является намного более чувствительным, нежели ESI или APCI и показывает более высокое соотношение сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона. Низкий сигнал фона во многом обусловлен высоким потенциалом ионизации стандартных растворителей, таких, как метанол и вода (10.85 и 12.62 эВ, соответственно), которые не ионизируются криптоновой лампой.

Недостатком ESI и APCI является то, что они образуют фоновые ионы растворителей. В дополнение к этому, ESI особенно подвержен эффектам подавления ионов, а APCI требует испарения при температурах 350-500°C, что может вызвать термическое разложение.

APPI производит ионизацию  двумя механизмами. Первый – простое  фотовозбуждение, инициирующее испускание электрона с образованием молекулярного катион-радикала (M+). APPI устройство воздействует светом с энергией выше, чем потенциалы ионизации (ИП) большинства целевых молекул, но ниже, чем ИП для большинства молекул растворителей и воздуха, тем самым исключая их как помехи. К тому же, из-за малой избыточной энергии, сообщаемой молекулам, достигается минимальная фрагментация.

Второй механизм – фотоиндуцированная химическая ионизация при атмосферном давлении, которая похожа на APCI в том, что она включает перенос заряда при протонировании (MH+) или потере протона ([M-H]-).

Для инициирования химической ионизации фотоионизирующийся реагент добавляется к элюенту. После фотоионизации реагента происходит перенос заряда на аналит. Типичными реагентами для положительной ионизации являются ацетон и толуол. Ацетон также служит реагентом для отрицательной ионизации.

Механизм ионизации (M+ или [M+H]+), который претерпевает молекула, зависит от сродства к протону аналита, растворителя и типа используемого дополнительного реагента.[9]

Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы (MALDI)

Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией при помощи матрицы (MALDI-MS) впервые была использована в 1988 году Танакой, Карасом и Хилленкампом. С тех пор он стал широко распространённым методом для пептидов, белков и большинства других биомолоекул (олигонуклеотидов, углеводов, природных веществ и липидов). Эффективный и направленный перенос энергии во время акта индуцированной лазером десорбции при помощи матрицы приводит к большому выходу ионов незатронутого аналита и позволяет проводить измерения соединений с субпикомолярной чувствительностью. Вдобавок, удобство MALDI для анализа гетерогенных образцов делает его очень привлекательным для масс-анализа сложных биологических образцов, как, например, гидролизат белков.

 

 

Хотя точный механизм десорбции/ионизации для MALDI неизвестен, принято считать, что MALDI вызывает ионизацию и перевод образца из конденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и индивидуализации молекул образца из матрицы (рис. 1.14). В MALDI анализе аналит сначала сокристаллизуется с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглощающей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матрицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. Матрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекулы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера. Молекулы, чувствительные к лазерному излучению, поэтому защищены от прямого возбуждения УФ-лазером.

Матрица MALDI – нелетучий твёрдый материал, обеспечивающий процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения. Как результат, и матрица, и любой образец, встроенный в неё, испаряются. Матрица также служит для того, чтобы минимизировать ущерб образцу от лазерного излучения, поглощая большую часть падающей энергии.

Оказавшись в газовой фазе, десорбированные заряженные молекулы затем электростатически направляются из MALDI устройства ионизации в масс-анализатор. Времяпролётные (TOF) масс-анализаторы часто используются для разделения ионов по отношению массы к заряду (m/z). Импульсная природа MALDI очень удобна для TOF анализаторов, т.к. начальный момент времени можно засекать как момент лазерного импульса.