История изучения NO

История изучения NO

Оксид азота давно печально известен своей ядовитостью. Высокая токсичность оксида азота обусловлена наличием в его структуре неспаренного электрона. Ранние работы по NO  не позволяли говорить о каких-либо благотворных или регуляторных эффектах этой чрезвычайно  лабильной молекулы с коротким временем жизни (6-10сек).

И хотя у человека имеет  место выделение нитратов и нитритов, считалось, что они попадают в организм исключительно с пищей. Поэтому, когда в 1956г. англичане Магги и Барнз установили, что нитраты, содержащиеся в копченостях и консервах, превращаются в организме в канцерогенные нитрозоамины,  люди бросились менять свой рацион питания.  Однако,  в начале 80-х было установлено,  что пища не единственный и даже не главный источник нитритов и нитратов. был сделан вывод,  что нитриты и нитраты образуются в результате окисления восстановленных форм азота,  в ходе которого в качестве промежуточного продукта может возникать NO.   Указание на то,  откуда и каким образом берутся нитраты, сам того не подозревая, дал больной, страдающий диареей. В моче этого больного было обнаружено большое количество нитратов. Его лечащий доктор Tannebaum  впервые связал интенсивное образование нитратов с воспалительным процессом.  Начиная с открытия Tannebaum,  количество публикаций,  посвященных оксиду азота,  стало расти буквально как снежный ком.  Бурный поток исследований функций NO  подтвердил представление об оксиде азота как об основном вазодилятаторе. Было показано,  что оксид азота участвует в иммунной защите организма,  вовлекаясь в цитотоксический процесс на самых последних    этапах и выполняя роль карающего меча иммунной системы. Выяснилось, что NO необходим для синаптической передачи нервного импульса, регуляции нормальной перистальтики кишки,  предотвращения гипоксической вазоконстрикции в легких и даже для нормализации эрекции.

Таким образом,  оксид азота  действительно является,  образно говоря,  мастером на все руки.   Как же столь ценная молекула образуется в организме человека?

Образование NO в организме.

В организме человека радикал NO   образуется из аминокислоты аргинина в результате реакции,  которая катализируется ферментом, получившим название NO- синтазы (NOS) (рис.1)

L-Arginin + NADPH2 + O2 →NO + L- Citrullin

Ферменты,  катализирующие продукцию большей части NO, уникальны по сложности организации,  включают рекордное число разнообразных кофакторов: FMN, FAD, гем и кальций-кальмодулин  и по крайней мере 3  субстрата-  аргинин,  кислород и NADPH .

Суммарное уравнение,  катализируемой NOS  реакции включает

пятиэлектронное (N-3-N+2)  окисление атома азота аргинина, сопряженное с окислением NADPH:

2L-Arginin+3NADPH +4O2 +3H+→ 2L-Citrullin +2 NO +3 NADP++4H2O

  Известно,  что молекулярный кислород используется для образования NO  и L-цитруллина.  Таким образом, NO-синтазный механизм образования NO –  это синтез NO  в присутствии кислорода. При патологических процессах, протекающих на фоне гипоксии или ишемии активность NO-синтазного механизма может снижаться и повышаться активность нитритредуктазных систем

Изучение действия нитритов на гемоглобин начал исследовать

Gamge A.  в 1868г.  

После поступления в кровь  ионы NO2 - проникают через плазматические мембраны.  Одновременно с окислением Hb  наблюдается образование Hb-NO-комплексов.  В опытах in vitro было установлено, что при взаимодействии ионов  NO2- c  дезоксиHb  осуществляется окислительно-восстановительная реакция, в ходе которой дезоксиHb окисляется в метНb, а ионы NO2-  восстанавливаются в NO. Hb2+ + NO2-+2H+ = метHb + NO+H2O Взаимодействуя с восстановленным гемоглобином, NO  образует стабильные Hb-NO-комплексы:

Hb2++ NO = Hb2+- NO.

Комплексы метHb  с NO  нестабильны и поэтому легко распадаются.   Образование О2- ,  Н2О2  и других активных форм кислорода может явиться причиной окисления NO  в нитриты и нитраты.  Таким образом,  значительный вклад в нитритредуктазную активность вносит Hb  в крови и миоглобин(Mb) в мышечной ткани. Учитывая,  что содержание гемоглобина в 250 раз выше, чем цитохрома С, можно предположить, что вклад нитритредуктазных систем в цикл NO  является основным.

Однако, мощная нитритредуктазная способность Hb крови делает его уязвимым по отношению    к метгемоглобинобразующему действию ионов NO2-2.  Поэтому наличие NO-синтазных систем,

лимитирующих образование  нитритных и нитратных ионов, обеспечивает защиту Hb  от окисления,  и,  следовательно, организма в целом от токсического действия нитросоединений. Кроме того,  без механизма эндогенного образованиянитритов/нитратов клетки и организм в целом оказались бы полностью зависимыми от поступления нитритов и нитратов.

Образовавшийся NO  оказывает  как аутокринное,  так и паракринное действие,  т.е.  будучи синтезирован в каких-либо клетках,  он способен влиять на метаболические процессы,  как в самих этих клетках,  так и в расположенных по соседству.  Это означает,  что молекулы NO,  несмотря на свою высокую химическую активность,  способны транспортироваться на расстояния,  превышающие по крайней мере в несколько раз клеточные размеры .

На пути к клеточным  мишеням паракринное действие молекул NO  может в значительной степени ослабляться под действием различных факторов.

Каковы же клеточные мишени NO?

Во-первых,  это железосодержащие ферменты и белки,  такие как гуанилатциклаза  (Гц),  собственно сама NOS, Hb, митохондриальные ферменты, ферменты цикла Кребса, ферменты

синтеза белка и ДНК.  Связывание NO  с железосодержащим участком фермента приводит к их изменению активности. Взаимодействие NO с этими мишенями имеет важное значение в

цитотоксическом действии макрофагов,  в расслаблении мышц сосудов и ЖКТ,  в переносе кислорода,  образовании АТФ и формировании долговременной памяти.

Вторая важная молекулярная мишень для оксида азота - это белки, содержащие SH=группы. NO служит эффективным катализатором образования дисульфидных мостиков. Благодаря взаимодействию с SH=группами NO может регулировать такой важный для клетки

процесс, как биосинтез  белка.

 Наконец, третья важная  молекулярная мишень - активные формы кислорода. NO  связывается с кислородом с образованием чрезвычайно токсичных соединений – пероксинитритов.

Последние по токсичности  во много раз превосходят сам NO.

Образование пероксинитритов выступает существенным элементом во многих патофизиологических процессах,  включая септический шок, а также ишемические и язвенные повреждения органов.

Оксид азота и система  кровообращения. 

Экономические потери от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)  в США составляют почти 60  млрд.  долларов. В развитых странах на лечение ССЗ расходуется значительная часть бюджета

здравоохранения.  В некоторых  из них на лечение этой группы заболеваний приходится до 12-13%  от общих затрат на медицинское обслуживание.   Многие из выходящих наинвалидность больных теряют работоспособность в связи с болезнями сердца и сосудов.  Таким образом,  профилактика и лечение ССЗ представляет собой не только медицинскую,  но и социально-экономическую проблему.

После успеха,  обусловленного широким внедрением принципов интенсивного контроля за больными острым инфарктом миокарда(ИМ),  госпитальная летальность в этой группе,  повсеместно снизившись к началу 70-х годов, на протяжении последующих лет оставалась стабильной.  Вместе с тем,  изменилась структура непосредственных причин летального исхода от ИМ в условиях стационара: нарушения ритма сердца, преобладавшие до введения интенсивного контроля за деятельностью сердца, уступили первое место недостаточности кровообращения и разрывам сердца. Общая летальность при ИМ составляет 30-35% (в США 140 человек в день).  Большая часть больничной летальности приходится на первые двое суток,  поэтому основные лечебные мероприятия чрезвычайно важны именно в этот период.

Указанное обстоятельство делает проблему разработки новых критериев прогноза ИМ по-прежнему актуальной,  во многом определяющей успешное предупреждение и лечение различныхего осложнений. 

Извеcтно,  что основными патофизиологическими    механизмами

развития ИМ служат тромбоз  атеросклеротически измененной коронарной артерии,  ее спазм или чаще комбинация этих факторов. И тромбоз, и спазм, которые вначале рассматривались, как независимые патофизиологические процессы,  обладают синергическим действием.  При этом важное значение имеют предшествующие или сопутствующие повреждения эндотелия и агрегация тромбоцитов.  Последствия ишемии определяются не столько гемодинамическими изменениями как таковыми, сколько развивающимся при этом тканевым повреждением.  По этой причине растет исследовательский интерес в направлении изучения каскада метаболических реакций, развертывающегося на этапе от ишемии к повреждению миокарда. 

В свое время,  изучая механизмы  расширения кровеносных сосудов,  американский фармаколог  Furchgott  обнаружил,  что ацетилхолин взаимодействует с рецепторами клеток эндотелия кровеносных сосудов,  что приводит к образованию малых молекул,   мигрирующих в мышечный слой и вызывающих его расслабление .Эти молекулы получили название -   расслабляющий фактор из эндотелия (ЭФР).

В течение длительного  времени ученые не могли идентифицировать природу этого фактора.  Однако,  несмотря на это было сделано одно очень важное открытие –  фактор расслабления стимулирует образование циклического гуанозинмонофосфата  (цГМФ),  который служит вторичным посредником для нейромедиаторов и гормонов,  способных стимулировать гуанилатциклазу и обладающих вазодилятирующим действием.  Идентифицировать природу расслабляющего фактора из эндотелия помогло изобретение Альфреда Нобеля.

 Более ста лет тому  назад Нобель изобрел нитроглицерин –  активный химический компонент динамита. Со времени этого изобретения прошло несколько десятков лет,  и только в конце 70-х годов ученый Murad установил молекулярный механизм действия нитроглицерина.  Оказалось,  что нитроглицерин и органические нитраты сами по себе не активны, и вызывают расширение коронарных артерий благодаря тому, что в ходе их превращений образуется оксид азота.  Более того, оказалось,  что NO  оказывает расслабляющее действие на мышечный слой сосудистой стенки путем стимуляции образования цГМФ,  точно также как это делает загадочный фактор расслабления из эндотелия. И наконец,  в 1987  году была доказана идентичность фактора расслабления из эндотелия и оксида азота.

Однако,  некоторые исследования ставят под сомнение эту идентификацию  .   Возможно,  ЭФР представляет собой нитрозосоединение,  активным вазодилятирующим компонентом которого выступает NO.  Когда нейромедиатор ацетилхолин и другие вазодилятаторы связываются с клетками эндотелия сосудов в этих клетках повышается активность NO синтазы и увеличивается содержание NO.  Молекула NO  мигрирует в прилежащие мышечные клетки,   активирует синтез цГМФ и вызывает их расслабление

NO в настоящее время  рассматривается как эндогенный вазодилятатор. Антигипертензивные и антиагрегационные свойства оксида азота непосредствеено связаны с его способностью повышать активность гуанилатциклазы  .  Энзим гуанилатциклаза существует в двух формах:  растворимой и мембраносвязанной.  Установлено,  что эти формы различаются как по структуре, так и  по механизмам регуляции. Сосудорасщиряющее  действие NO  связано с активацией растворимой формы гуанилатциклазы по гемзависимому механизму и с увеличением содержания цГМФ . 

Накапливающийся цГМФ активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу, а также Са-АТФазу, что в свою очередь приводит к выходу Са из мышечных клеток,  их релаксации и в конечномитоге – к вазодилятации.

Ингибирующий эффект оксида азота на агрегацию тромбоцитов также связывали со способностью NO активировать растворимую гуанилатциклазу.  Механизм    антиагрегационного действия NO стал проясняться после исследования роли гуанилатциклазы в регуляции процесса агрегации тромбоцитов.  Гуанилатциклаза регулирует агрегацию по механизму обратной связи:  инициация агрегации способствует активации фермента, а накапливающийся цГМФ опосредует сигнал к дезагрегации.  Функционирование тромбоцитарной гуанилатциклазы и агрегационная способность тромбоцитов взаимосвязаны.  Уровень продукции NO зависит  от скорости кровотока, которая, в свою очередь,   зависит от тонуса сосудов.   Таким образом,  посредством NO  осуществляется вазальная ауторегуляция кровотока.  Ослабление действия любого из звеньев этого механизма приводит к развитию гипертензии.  Кроме того, важнейшим в практическом отношении свойством  NO выступает его способность ингибировать   адгезию нейтрофилов на стенках сосудов.

Главный фактор,  участвующий  в инактивации NO, ограничивающий его распространение и снижающий егоконцентрацию - это супероксидный радикал О2.

  В кровеносной системе  увеличение продукции О2 фагоцитирующими клетками или эндотелиальными клетками  (в период перехода от ишемии к реперфузии)  провоцирует спазм.   Предотвращение инактивации оксида азота супероксидом  объясняет способность супероксиддисмутазы улучшать микроциркуляцию при воспалительных процессах и нормализовать кровоток после тромбозов,  вазоспазма  и других нарушений кровообращения.

Кардиомиоциты содержат как конституитивную,  так и индуцибельную NOS (iNOS).   Генерация оксида азота конституитивной NOS  играет важную роль в поддержании гомеостаза.   Индуцибельная кальций-независимая NOS экспрессируется в тканях-мишенях    после стимуляции эндотоксином и некоторыми цитокинами.  Этот путь синтеза NO имеет место в патологических условиях и  приводит к чрезмерной вазодилятации и повреждению тканей.  Оба пути биосинтеза NO играют важную роль в сердце млекопитающих.  Исследования на крысах продемонстрировали,  что кардиомиоциты экспрессируют iNOS  под действием цитокинов-индукторов.  Эти данные позволили предположить , что экспрессия iNOS в сердце человека должна происходить в случае иммунныхнарушений,   в связи с чем были обследованы пациенты с дилятационной кардиомиопатией (ДКМП).

Биопсийный материал из миокарда правого желудочка исследовался у больных ДКМП с явными клиническими проявлениями сердечной недостаточности. Измерение активностииндуцибельной и конституитивной NOS  показало,  что кардиомиоциты больных содержат значительно более высокий уровень iNOS по сравнению с относительно низкой активностью cNOS.    Миоциты экспрессируют iNOS только после стимуляции цитокинами.   Эти результаты доказывают,  что iNOS появляется в миокарде только при наличии дефектов в работе иммунной системы. В работе Wildhirt S. M.,1995  изучалось участие NOS в патогенезе экспериментального ИМ у кроликов.  Содержание фермента измерялось с помощью  моноклональных антител. Оказалось, что уровень iNOS  значительно возрастал в инфарцированном миокарде спустя 48 часов после перевязки коронарной артерии у кроликов.  В течение последующих 14  дней активность iNOS оставалась высокой,  и лишь позже начинала постепенно снижаться. Иммуногистохимические методы позволили доказать, что  макрофаги служат основным источником экспрессии iNOS. Измерение свободного NO методом электронного парамагнитного резонанса, проведенные при перевязке левой коронарной артерии у крыс, показали, что уровень NO в течение первых 2 часов после экспериментального инфаркта    в сердце и печени оставался неизменным.  Через 3  часа было зарегистрировано кратковременное,  но значительное снижение уровня NO и затем быстрое 2 кратное увеличение к пятому часупосле экспериментального инфаркта.  Высокий уровень NO сохранялся в течение 24 часов. Эти результаты дают возможность предполагать, что увеличение продукции NO может играть роль в падении периферического сопротивления при остром ИМ,  в частности при кардиогенном шоке. Во многих работах исследуется экспрессия iNOS  в кардиомиоцитах,  способы и условия ее активации.  Интересные результаты получили Jean Luc Balligand  и соавт.,1994  исследуя содержание обоих типов NOS  в кардиоцитах взрослых крыс в ответ на действие интерлейкина,  липополисахаридов,  фактора некроза опухолей и кортикостероидов.  Для оценки содержания iNOS  и динамики содержания этого фермента применялся анализ Western immunoblot.  Исследовалась также последовательность гена iNOS.  Кроме этого изучался уровень свободного NO  в кардиомиоцитах крыс с помощью NO селективного микросенсора. Авторы показали,  что интерлейкин и интерферон,  действуя вместе,  увеличивали содержание iNOS  в культуре клеток с максимальной экспрессией через 12  часов.  Высокий уровень активности iNOS  держался в течение более 24  часов в присутствии интерлейкина и интерферона.  Эти временные отношения соответствуют таковым,  найденным в гепатоцитах мышей в ответ на введение липополисахаридов и цитокинов. Период полужизни NOS  составил 4  часа.  Исследование нуклеотидной последовательности гена NOS  показало ее идентичность с последовательностью гена iNOS  из макрофагов мыши и человека. Обработка простагландинами снижала уровеньактивности iNOS. С помощью NO  селективного микросенсора было доказано,  что кардиомиоциты крыс служат источником NO.