Ингибирование ферментов

Содержание

Введение…………………………………………………………………………...2

1.Типы ингибирования активности ферментов…………………………..……..3

1.1 Обратимое ингибирование…………………………………...………………4

1.1.1 Конкурентное ингибирование…………………………………..………….4

1.1.2 Неконкурентное ингибирование………………………….……………..…7

1.1.3 Бесконкурентное ингибирование………………………………..…………8

1.2 Необратимое ингибирование…………………………………………..……10

1.3 Аллостерическое ингибирование……………………………...……………12

2. Применение ингибиторов ферментов………………………..………………13

Список использованной литературы………………………………….………..14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Известно, что активность ферментов сравнительно легко может быть уменьшена с помощью разнообразных воздействий. Такое снижение скорости ферментативных реакций принято называть торможением активности, или ингибированием ферментов.

Ферменты являются белками, соответственно их активность можно снизить или полностью ликвидировать путем воздействий, приводящих к денатурации белков (нагревание, действие концентрированных кислот, щелочей, солей тяжелых металлов и т.п.) Это неспецифическое подавление активности ферментов, имеющее значение при изучении ферментативных реакций, не представляет особого интереса для исследования их механизма. Гораздо большее значение имеет исследование ингибирования с помощью веществ, специфически и обычно в небольших количествах, взаимодействующих с ферментами – ингибиторов ферментов. Расшифровка механизмов многих биологических процессов, таких как гликолиз, цикл Кребса и других, стала возможной лишь в результате применения специфических ингибиторов различных ферментов.

Некоторые ингибиторы ферментов являются для организма животных и человека эффективными лекарственными веществами, другие — смертельными ядами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Типы ингибирования активности ферментов

Ингибиторы взаимодействуют с активными центрами молекулы фермента, инактивируя функциональные группы белков. Они могут взаимодействовать с металлами, входящими в состав молекул ферментов и фермент-субстратных комплексов, инактивируя их. Высокие концентрации ингибиторов разрушают четвертичную, третичную и вторичную структуры молекулы фермента, вызывая его денатурацию.

Рис 1. Схема активирования и ингибирования действия фермента (по Ю. Б. Филипповичу): а. – аллостерический центр фермента; К - каталитический центр; с - субстратный центр

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.1 Обратимое ингибирование

Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное, в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.

1.1.1 Конкурентное ингибирование

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром, но в отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. Отличительная особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата. Например, если при заданных концентрациях субстрата и конкурентного ингибитора активность фермента подавлена на 50 %, то мы можем уменьшить степень ингибирования, повысив концентрацию субстрата.

По своей трехмерной структуре конкурентные ингибиторы обычно напоминают субстрат данного фермента. Благодаря такому сходству конкурентному ингибитору удается "обмануть" фермент и связаться с ним. Конкурентное ингибирование можно количественно изучать на основе теории Михаэлиса-Ментен. Конкурентный ингибитор I просто обратимо присоединяется к ферменту Е, образуя с ним комплекс Е + I = EI.

Конкурентное ингибирование проще всего можно распознать экспериментальным путем, определив влияние концентрации ингибитора на зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата. Для выяснения вопроса о том, по какому типу - конкурентному или неконкурентному - происходит обратимое ингибирование фермента, используют метод двойных обратных величин. Из графиков, построенных в двойных обратных координатах, можно определить также значение константы диссоциации комплекса фермент.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным) центром (см. рис. 2).

Рис. 2. Общий принцип конкурентного ингибирования (схема по В.Л. Кретовичу). Е - фермент; S - субстрат; Р1 и Р2 - продукты реакции; I - ингибитор.

В качестве примера можно привести действие малоновой кислоты на реакцию, которая катализируется сукцинатдегидрогеназой и связана с превращением янтарной кислоты в фумаровую. Добавление малоновой кислоты к реакционной смеси снижает или полностью останавливает ферментативную реакцию, так как она является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы. Сходства малоновой кислоты с янтарной достаточно для образования комплекса с ферментом, однако распад этого комплекса не происходит. При увеличении концентрации янтарной кислоты она вытесняет малоновую кислоту из комплекса, в результате активность сукцинатдегидрогеназы восстанавливается.

Рис. 3. Конкурентное ингибирование реакции превращения янтарной кислоты в фумаровую под действием малоновой кислоты.

 

Структуры субстрата (сукцинат) и ингибитора (малонат) все же несколько различаются. Поэтому они конкурируют за связывание с активным центром, и степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Таким образом, ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя фермент-ингибиторный комплекс. Этот тип ингибирования иногда называют ингибированием по типу метаболического антагонизма (см. рис. 3).

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

 

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции.

Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных по конкурентному типу. Например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

В структуру пептидогликана клеточной стенки бактерий включен D-аланин, отсутствующий в организме животных и человека. Для синтеза клеточной стенки бактерии при помощи фермента аланин-рацемазы превращают L-аланин животных в D-форму. Аланин-рацемаза характерна для бактерий и не обнаружена у млекопитающих. Следовательно, она представляет хорошую мишень для ингибирования лекарственными препаратами. Замещение одного из протонов метильной группы на фтор дает фтораланин, с которым связывается аланин-рацемаза, что приводит к ее ингибированию.

Некоторые аналоги витамина В6 и фолиевой кислоты, в частности дезоксипиридоксин и аминоптерин, действуют как конкурентные, так называемые коферментные, ингибиторы (или антивитамины), тормозящие многие интенсивно протекающие при патологии биологические процессы в организме. Применение подобных аналогов в медицинской практике (в частности, в дерматологии и онкологии) основано на конкурентном вытеснении коферментов из субстратсвязывающих центров ключевых ферментов обмена.

Таким образом, можно конструировать лекарственные вещества, ингибирующие ферменты по конкурентному типу. Чтобы быть эффективным, ингибитор должен иметь высокое сродство к ферменту. В противном случае необходимо назначать большие дозы лекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратом за активный центр фермента (В.П. Комов, В.Н. Шведова, 2004).

1.1.2 Неконкурентное ингибирование

Неконкурентное ингибирование тоже обратимо, но не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата

В случае неконкурентного ингибирования ингибитор присоединяется к ферменту не в активном центре, где связывается субстрат, а совсем в другом месте. При этом конформация молекулы фермента изменяется таким образом, что происходит обратимая инактивация его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторы связываются обратимо как со свободным ферментом, так и с комплексом ES, образуя неактивные комплексы EI и ESI.

Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента. Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится.

Использование графиков, построенных в двойных обратных координатах для анализа данных, полученных при исследовании ингибирования ферментативных реакций, позволяет легко отличать конкурентные ингибиторы от неконкурентных.

Наиболее важные неконкурентные ингибиторы представляют собой образующиеся в живых организмах промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться со специфическими участками на поверхности некоторых регуляторных ферментов и изменять при этом активность их каталитических центров. Примером может служить ингибирование L-треониндегидратазы L-изолейцином.

Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

1.1.3 Бесконкурентное ингибирование

В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого типа торможения был предложен термин "бесконкурентное ингибирование".

Бесконкурентное ингибирование имеет место, когда ингибитор взаимодействует с ферментом только в составе фермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду.

Примером необратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганические вещества, применяемые в качестве инсектицидов.

Известно, кроме того, так называемое бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса ESI.

 

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, что катализ становится невозможным

Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS.

Ингибирование субстратом — частный случай бесконкурентного ингибирования, когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствует образованию продукта

Активность многих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколько механизмов этого процесса.

Если в образовании фермент-субстратного комплекса участвует несколько функциональных групп фермента, то возможно одновременное присоединение к активному центру двух или более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивного комплекса.

В случае избытка субстрата возможно его присоединение не только к активному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативной реакции.

Увеличение концентрации субстрата может повысить ионную силу реакционной среды и, как следствие, затормозить скорость ферментативной реакции.

Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связываться с ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким образом, что скорость прямой реакции снижается.

1.2 Необратимое ингибирование

Необратимые ингибиторы связывают или разрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности. Происходит формирование стабильного комплекса ингибитора с ферментом, ведущее к его необратимой инактивации. Случай необратимого ингибирования можно обнаружить по тому признаку, что при разбавлении раствора не происходит повышения удельной активности фермента, как в случае обратимого ингибирования.