Инфракрасная спектроскопия и ее практическое применение в фармацевтическом анализе

Ревалидация. Прошедший валидацию и признанный пригодным для применения БИК-метод идентификации или количественного анализа нуждается в последующей периодической валидации (ревалидации). При установлении отклонений необходима корректировка метода. Необходимость ревалидации зависит от характера изменений.

БИК-метод нуждается в ревалидации, если:

– в библиотеку добавляется новый объект (для качественного анализа);

– есть предпосылки к изменению характеристик объектов, спектры которых уже включены в библиотеку (изменение технологии производства

(синтеза), состава, качества  исходного сырья упаковки и  т. д.);

– обнаружены иные изменения и/или несоответствия в свойствах анализируемых объектов или методике.

Перенос методик. При переносе методик идентификации и количественного анализа с одного прибора на другой должны учитываться спектральные характеристики используемых спектрофотометров (разрешение, диапазон волновых чисел и др.). Спектрофотометры с высокой фотометрической точностью и точностью по волновому числу (например, Фурье-спектрофотометры), позволяют осуществить прямой перенос методов как качественного, так и количественного анализа без дополнительных манипуляций. Если прямой перенос невозможен, применимы различные математические способы для переноса моделей.  После перенесения методов необходима их ревалидация.

Хранение данных. Хранение данных осуществляется в электронном виде в соответствии с требованиями программного обеспечения. При этом

необходимо сохранять исходные спектры, не подвергшиеся математической обработке, с целью их возможного дальнейшего использования при оптимизации библиотек или методов [7].

Ряд исследований демонстрирует широкие возможности БИК-спектроскопии в отношении установления подлинности фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов. Более того, в ряде случаев при соответствующей калибровке методик возможно также и установление происхождения (производителя) ЛС. Одним из основных преимуществ данного метода является практически отсутствующая пробоподготовка. Более того, в ряде случаев субстанции и препараты можно сканировать через упаковку. Диффузная отражательная спектроскопия в ближней ИК-области спектра является уникальным физическим методом, позволяющим осуществлять определение значительного числа показателей в продуктах сложного химического строения. Приборы, основанные на этом методе (ИК-анализаторы) и представляющие собой спектрометры нового поколения, являются наиболее перспективными экологически безопасными приборами для экспрессного определения широкого диапазона показателей качества пищевых и сельскохозяйственных продуктов и материалов. Слабая абсорбция в ближней ИК-области и использование диффузного отражения от анализируемой пробы делает возможным прямой анализ продукта, что практически исключает сложную пробоподготовку и существенно увеличивает измеряемые концентрации [10].

8. Cпектроскопия с преобразованием Фурье

Фурье-спектроскопия — метод оптической спектроскопии, позволяющий получать спектр в результате обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по частоте) [13].

Комплекс аппаратуры, выполняющий эти операции, называется Фурье-спектрометром (ФС). В него, как правило, кроме двухлучевого интерферометра входят осветитель, детектор излучения, усилитель, аналогово-цифровой преобразователь и ЭВМ.

Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала — неподвижное и подвижное, и полупрозрачную светоделительную пластину, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника, попадая на пластину, разделяется на два. Один из них направляется на неподвижное зеркало, второй — на подвижное зеркало; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце и поступает на детектор излучения. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего светового потока периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения и смещения подвижного зеркала [12].

Будучи значительно сложнее обычных спектрометров, Фурье-спектрометры обладают рядом преимуществ над другими спектральными приборами.

С помощью ФС можно регистрировать одновременно весь спектр. Благодаря тому, что в интерферометре допустимо входное отверстие больших размеров, чем щель спектральных приборов с диспергирующим элементом такого же разрешения, Фурье- спектрометры по сравнению с ними имеют выигрыш в светосиле, что позволяет:  уменьшить время регистрации спектров; увеличить отношение сигнал-шум (так называемое «преимущество Фелгетта»); повысить разрешение; уменьшить габариты прибора.

Все ИК – спектрофотометры независимо от конструкции имеют общие элементы: источник излучения, оптическую систему, приемник, систему усиления сигнала.

Источники излучения. Идеальным источником для ИК – спектроскопии был бы монохроматический излучатель высокой интенсивности, непрерывно перестраиваемый в широком частотном интервале. Несмотря на то, что существуют лазеры с перестраиваемой частотой, в настоящее время наиболее распространенными являются нагреваемые до температуры 1200 – 1400 К источники с широкой областью излучения: глобар (карбид кремния), штифт Нернста (оксиды циркония, тория, иттрия), нихромовая спираль, платиновая проволока с керамическим покрытием. В дальней ИК области используется излучение стенок ртутной лампы низкого давления. Излучательная способность тепловых источников подчиняется закону Планка для излучения абсолютно черного тела. Ведутся исследования по применению терагерцового излучения (субмиллиметровый диапазон) в спектроскопии.

Оптические системы. Назначение оптической системы – направлять излучение источника по нужному пути с минимальными потерями. Использование отражательных зеркал с наружным покрытием (напыленный алюминий, просветляющие покрытия) позволяет избежать хроматической аберрации. Отражательная оптика может иметь плоские, сферические, параболические, эллиптические или тороидальные поверхности. Разработано большое число типов оптических систем спектрофотометров. Классические схемы спектральных приборов рассмотрены в специальной литературе

Приемники излучения. Приемники ИК излучения делятся на две группы: тепловые и фотоэлектронные. Первая группа включает термоэлементы (термопары), болометры (сопротивления с большим температурным коэффициентом), пневматические приемники, пироэлектрические приёмники. Пироэлектрические детекторы (на основе триглицинсульфата (NH2CH2COOH)3 H2SO4) используются в интерферометрах из-за их высокой чувствительности в широкой ИК области. В основе работы фотоэлектронных полупроводниковых приемников, к которым относятся фоторезисторы и фотодиоды, лежит явление внутреннего фотоэффекта. В ближнем ИК диапазоне наиболее распространены фотодиоды на основе германия и твёрдого раствора InGaAs. В среднем ИК диапазоне применяются охлаждаемые жидким азотом фотодиоды на основе твёрдого раствора HgCdTe (MCT Mercury-Cadmium-Tellurium). Полупроводниковые детекторы для работы в низкочастотной области требуют охлаждения до низких (азотных или гелиевых) температур. Ширина запрещённой зоны определяет длинноволновую границу чувствительности фотоэлектронных приёмников.

Оптические материалы. Так как обычные оптические стёкла поглощают среднее и длинноволновое ИК излучение, то в качестве материалов для изготовления окон кювет и светоделителей используют монокристаллы различных солей. В спектроскопии внутреннего отражения применяют материалы с высокими показателями преломления. Некоторые особенности и преимущества спектроскопии  с преобразованием Фурье заключается в том, что  в классических спектрофотометрах регистрация спектра производится во времени при последовательном движении выходящего из монохроматора спектра по выходной щели. Этот процесс называется сканированием по волновым числам. Спектрометры с преобразованием Фурье принадлежат к типу многоканальных приборов, что приводит к значительному снижению энергетических потерь. Фелжетт и Жакино независимо друг от друга показали, что восстановление спектра с помощью Фурье-преобразования интерферограммы имеет большое преимущество перед последовательной, поэлементной регистрацией того же самого спектра. Используя один приемник, можно исследовать все спектральные элементы одновременно, подобно тому, как это делается в случае фотографической регистрации спектров. В связи с этим Фелжетт и назвал метод “мультиплексспектрометрией” [20].

9. Методы и приемы подготовки проб  в ИК спектроскопии

Разнообразие приемов подготовки проб для съемки ИК-спектров почти беспредельно, и исследователь должен выбрать один из них, наилучшим образом подходящий для решения конкретной проблемы с учётом свойств исследуемого объекта. Здесь представлены некоторые основные приёмы пробоподготовки.

В связи с тем что физическое состояние образца может сильно влиять на его ИК-спектр, целесообразно заранее определить иерархию используемых приемов Последовательность их применения определяется поставленными перед исследователем задачами. Например, в лаборатории, проводящей химические работы общего характера, спектры жидких нелетучих проб целесообразно снимать в виде жидких плёнок или раздавленных между солевыми пластинками капель. ИК спектры летучих жидкостей регистрируют в тонких кюветах или в виде растворов, если вещество растворимо, при этом необходимо учитывать собственное поглощение растворителя. Для органических порошкообразных веществ логична следующая последовательность: 1) суспензия в вазелиновом масле (или другом разбавителе), 2) таблетка с КВr или спектр диффузного отражения, 3) раствор, 4) пиролизат. Такие методы, как нарушенное полное внутреннее отражение (НПВО), обычно оставляют для исследования специальных случаев (например, полимерных материалов) [9].

Жидкие пробы. Одним из простейших приемов приготовления образцов является метод жидкой пленки. Он применяется для получения качественных обзорных спектров нелетучих, нереакционноспособных, нерастворимых жидкостей. Капля вещества сжимается между двумя солевыми пластинками или помещается на плоскую стеклянную поверхность, а затем “вытирается” солевой пластинкой. Желательно, чтобы в пределах сечения светового луча спектрометра толщина образца была более или менее одинаковой, без воздушных пузырьков. Очевидно, что спектры, полученные таким путем, не очень воспроизводимы, и не пригодны для количественной обработки (толщина поглощающего слоя неизвестна). Для получения спектров растворимых в летучих растворителях смол или лаков тонкий слой соответствующего раствора, нанесенного на солевое окно, аккуратно высушивают под тепловой лампой, феном или в вакуумном эксикаторе, добиваясь полного удаления растворителя.  В некоторых случаях исследователи предпочитают приготовление проб в виде растворов, хотя этот метод более трудоемок, чем другие, его преимущество заключается в высокой воспроизводимости и в возможности выполнять количественные измерения.

Рис.9. Разборная жидкостная кювета

Требования к растворителям. Выбор растворителя всегда является результатом компромисса. Так как все стандартные органические растворители имеют ИК спектры, то необходимо выбирать те из них, в которых вещество достаточно хорошо растворимо и которые имеют окна прозрачности в аналитических областях спектра. Растворитель должен быть химически инертным, поддаваться очистке и осушке. В тех областях спектра, где пропускание растворителя падает ниже 30%, чувствительность измерений будет понижена, а шумы и погрешности измерений будут возрастать.

Выбор концентрации. Большинство органических веществ дает приемлемые спектры в области 625 – 4000 см-1 в кювете толщиной 0,1 мм при концентрациях около 1 г /10 мл. При работе ниже 600 см-1 могут понадобиться более высокие концентрации. В случае сильнопоглощающих фтор- или кремнийорганических соединений концентрация может быть снижена до 0,2 г /10 мл. Для содержащих полярные группы соединений нужно иметь ввиду возможность проявления в спектрах межмолекулярных взаимодействий (например, водородных связей).

Толщина поглощающего слоя. На выбор толщины кюветы может влиять количество имеющегося в распоряжении образца или его растворимость. Очень тонкие кюветы (<0,05 мм) трудно изготавливать, заполнять и опорожнять, а в кюветах толщиной более 0,2 мм поглощение растворителя может оказаться слишком сильным. Удобными для работы являются кюветы толщиной 0,1 мм. В специальных случаях для анализа следовых количеств в узких областях высокой прозрачности растворителя могут использоваться кюветы с толщиной поглощающего слоя до 1см. Перед приготовлением образца с большой толщиной поглощающего слоя, необходимо проверить, пропускание растворителя и убедиться в его чистоте.

Определение толщины кювет основано на том, что в спектре пустой чистой кюветы с плоско- параллельными окнами наблюдаются регулярные максимумы и минимумы, обусловленные интерференцией

Водные растворы. Из-за очень сильного поглощения жидкой воды в ИК области, применение водных растворов ограничено такими специальными областями, как биологические исследования. Использование жидкостных кювет толщиной менее 10 мкм из водостойких материалов - Ge, Si, Zn, Se позволяет проводить исследования в значительной части области “отпечатков пальцев”. Так как при дейтерировании частоты колебаний смещаются в область низких волновых чисел, то иногда в качестве растворителя используют тяжёлую воду.

Твердые вещества.

Сложности приготовления образцов твердых веществ, которые нерастворимы в обычных растворителях для ИК-спектроскопии, чаще всего возникают при их растирании до мелкодисперсных порошков, образующих суспензии (взвеси - mulls) в вазелиновом масле или КВr.

В обоих случаях цель состоит в создании однородного распределения частиц в луче, снижении рассеяния и в улучшении пропускания света взвешенными частицами в среде, имеющей близкий с образцом показатель преломления (иммерсия).

Суспензии в вазелиновом масле. Вазелиновое масло (nujol) широко применяется для приготовления суспензий, но его недостатком является сильное поглощение в области валентных (2800-3000 см-1) и деформационных (1350-1500 см-1) колебаний СН-связей. Это затруднение можно преодолеть, используя хлорированные или фторированные углеводороды.