Хроматографический метод анализа белков

 Новейшие  методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная  жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко  используются в фармакологии (при  создании и определении лекарственных  веществ), в клинической биохимии (при определении биологически  активных веществ в физиологических  жидкостях), в биотехнологических  процессах и производствах и  других областях: они позволяют  определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

 

 Аффинная  хроматография (хроматография по  сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

 

 Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки. Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

 

 где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V0 – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; Vi – объем растворителя внутри геля, мл; K – коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V0 , а первое – только после выхода объема V0+ Vi.

 Поскольку  молекулы белков, обладающие большими  молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен  сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V0, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V0+ К • Vi.

 Метод  нашел широкое применение в  препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических белков . Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

6. Высокоэффективная жидкостная  хроматография (ВЖКХ)

 

Высокоэффективная жидкостная хроматография – наиболее эффективный метод анализа органических проб сложного состава. Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:

• разделение пробы на составляющие компоненты;
• детектирование и измерение содержания каждого компонента.

 

 

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы.

Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени.

Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделения анализируемых веществ. Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

При анализе соединений с низкими ПДК (биогенные амины, полиароматические углеводороды, гормоны, токсины) из-за трудоемкости подготовки реальных проб особенно важной характеристикой становится чувствительность и селективность метода. Применение флуориметрического детектора позволяет не только снизить пределы обнаружения, но и селективно выделить анализируемые вещества на фоне матричных и сопутствующих компонентов пробы.

Метод ВЭЖХ применяется в санитарно-гигиенических исследованиях, экологии, медицине, фармацевтике, нефтехимии, криминалистике, для контроля качества и сертификации продукции.

В качестве блока подачи элюента используется насос "Питон" шприцевого типа, который имеет следующие особенности:

• отсутствие пульсаций давления при подаче растворителя;
• большой диапазон объемных скоростей потока;
• большой объем камеры насоса;
• расширяемость (возможность сочетать несколько блоков для создания градиентной системы).

В хроматографической системе могут использоваться различные типы детекторов, например, "Флюорат-02-2М" (спектральная селекция осуществляется фильтрами) или "Флюорат-02 Панорама" (спектральная селекция осуществляется монохроматорами). [8]

 

 

7. Применение

 

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и т. д.; изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов; диагностики в медицине; анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод; изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности хим. процессов.

В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью жидкостной хроматографии анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции. Жидкостную хроматографию используют также в парфюмерии, пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающей среды, в криминалистике. [9]

Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

 

 

По другому способу для присоединения белков к гидроксильной группе целлюлозы последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим-триазином, а затем продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка по схеме 2:

 

 

Конечно, число способов хроматографирования не ограничивается перечисленными выше. Часто хроматографию сочетают с другими физико-химическими методами, например с масс-спектрометрией, но в данной статье стоит задача познакомить читателя лишь с общими принципами хроматографии. Поэтому далее рассмотрим обработку результатов хроматографирования.

 

 

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае ферментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции «в объеме», так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков.

 

 

4.1. ТЕОРИЯ ХРОМАТОГРАФИИ  БЕЛКОВ

 

Теория хроматографии была разработана для низкомолекулярных соединений, и многие ее понятия и принципы не всегда подходят для описания взаимодействий белков и их поведения на адсорбентах. Среди особенностей, характерных для разделения высокомолекулярных полимеров, следует отметить такие, как ситовой эффект матрицы, большую разницу в силах взаимодействия белка с различными частями адсорбента и нередко высокую адсорбционную емкость адсорбентов (в г-см-3, хотя в молях она имеет обманчиво низкую величину). Биохимики привыкли воспринимать молекулярные взаимодействия в терминах констант диссоциации, которые часто можно соотнести с величинами Км в ферментативной кинетике. Применяя ту же концепцию констант диссоциации к процессу взаимодействия между белком и адсорбентом, можно разработать простую теорию хроматографии белков; это особенно полезно при описании аффинных методов.

Требования к белковым адсорбентам значительно отличаются от требований, предъявляемых к адсорбентам низкомолекулярных соединений. Структура адсорбента должна быть рыхлой, с тем чтобы белок мог проникнуть внутрь частиц и достичь центров связывания. Если же адсорбент имеет более плотную структуру, то для связывания с белком доступно лишь небольшое число^ Центров связывания на поверхности частицы, и емкость адсорбента значительно снижается. Кроме того, адсорбент по своей природе не должен оказывать вредного влияния на белки. Основной материал матрицы не должен сильно взаимодействовать с белком — адсорбционная способность обычно создается путем присоединения заместителей к предположительно инертной основе. Оба этих фактора делают стандартные типы ионообменных адсорбентов низкомолекулярных соединений неприемлемыми для работы с белками. Замещенные полистирольные смолы с большим числом сшивок не пропускают белки внутрь частиц. На их поверхности есть как гидрофобные, так и ионные группы, которые связываются с белком и затрудняют его элюцию. При большой плотности заряженных групп белок может связаться с адсорбентом практически необратимо. Считается, что сильно кислые заместители, например сульфогруппы, или сильно основные вредны, однако это терминологическая путаница: заряженная форма, используемая в ионном обмене, является сопряженным слабым основанием (например, сульфо-группы) или слабой кислотой (например, четвертичное аммониевое основание).

Первыми материалами, успешно использованными в колоночной хроматографии белков, были ионообменники на основе целлюлозы, разработанные Петерсоном и Собером [37]. Для сорбции из объема применялись также многие другие адсорбенты, но только некоторые из них пригодны для работы на колонке из-за плохих характеристик потока. Обработанный должным образом порошок целлюлозы приобретает пористую структуру, позволяющую белкам проникать внутрь частиц. Более того, модификация целлюлозы заряженными группами увеличивает и стабилизирует пористость структуры в результате взаимного отталкивания зарядов. Такие материалы оказались идеальными для ионообменной хроматографии белков, и до сих пор это наиболее широко используемые адсорбенты. Другие важные адсорбенты, применяемые для работы на колонке, также представляют собой главным образом адсорбенты на основе биополимеров— декстранов или агароз. Сюда входят многие истинно аффинные и модифицированные красителями «псевдоаффинные» адсорбенты, гидрофобные адсорбенты и некоторые ионообменные материалы. Единственным исключением является кристаллическая форма фосфата кальция (гидроксилапатит), который можно использовать для колоночной хроматографии; более же традиционный кальцийфосфатный гель не годится для набивки колонок. Теория хроматографии, изложенная ниже, применима ко всем этим адсорбентам, используемым как в колоночном варианте, так и при адсорбции «из объема».