Хроматографический метод анализа белков

Введение

 

Хроматография - это физико-химический метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях.

Метод основан на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами - подвижно и не подвижной. Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной фазой – твердое вещество, которое называют носителем. При движении подвижной фазы вдоль неподвижной, компоненты смеси сорбируются на неподвижной фазе. Каждый компонент сорбируется в соответствии со сродством к материалу неподвижной фазы (вследствие адсорбции или других механизмов). Поэтому неподвижную фазу называют также сорбентом. Захваченные сорбентом молекулы могут перейти в подвижную фазу и продвигаться с ней дальше, затем снова сорбироваться. Таким образом, хроматографию можно определить как процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Чем сильнее сродство компонента к неподвижной фазе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается на сорбенте; тем медленнее его продвижение вместе с подвижной фазой. Поскольку компоненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, при перемещении смеси вдоль сорбента произойдет разделение: одни компоненты задержаться в начале пути, другие продвинуться дальше. В хроматографическом процессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью) аспекты. В зависимости от агрегатного состояния фаз, механизма взаимодействия и оформления различают основные виды хроматографии, которые приведены в таблице:

 

Неподвижная фаза	Подвижная фаза
	газообразная	жидкая
Твердая	Газовая адсорбционная хроматография	Жидкостная адсорбционная, ионообменная, тонкослойная, осадочная хроматография
Жидкая	Газожидкостная распределительная хроматография, капиллярная	Жидкостная распределительная, высокоэффективная жидкостная, гельхроматография

 

БЕЛКИ- высокомолекулярные  природные  полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью —СО—NH—. Каждый белок характеризуется специфичной  аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной  структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее 50% сухой массы органических  соединений  животной клетки. Функционирование белков лежит в основе важнейших процессов жизнедеятельности организма. Обмен веществ (пищеварение, дыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клетки в целом неразрывно связаны с активностью ферментов – высокоспецифичной  катализаторов биохимических  реакций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований составляют структурные белки. Они же формируют состов клеточных органелл (митохондрий, мембран и др.). Расхождение хромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных и человека осуществляются по единому механизму при посредстве белков сократительной системы. Важную группу составляют регуляторные белки, контролирующие биосинтез белков и нуклеиновых кислот. К регуляторным белкам относятся также пептидно-белковые гормоны, которые секретируются эндокринными железами. Информация о состоянии внеш. среды, разл. регуляторные сигналы (в т. ч. гормональные) воспринимаются клеткой с помощью спец. рецепторных белков, располагающихся на наружной поверхности плазматич. мембраны. Эти белки играют важную роль в передаче нервного возбуждения и в ориентированном движении клетки (хемотаксисе). В активном транспорте ионов, липидов, Сахаров и аминокислот через биол. мембраны участвуют транспортные белки, или белки-переносчики. К последним относятся также гемоглобин и миоглобин, осуществляющие перенос кислорода. Преобразование и утилизация энергии, поступающей в организм с питанием, а также энергии солнечного излучения происходят при участии белков биоэнергетич. системы (напр., родопсин, цитохромы). Большое значение имеют пищевые и запасные белки (см., например, Казеин, Проламины), играющие важную роль в развитии и функционировании организмов. Защитные системы высших организмов формируются защитными белками, к которым относятся иммуноглобулины (ответственны за иммунитет), Б. комплемента (ответственны за лизис чужеродных клеток и активацию иммунологич. функции), белков системы свертывания крови (см., напр., Тромбин, Фибрин)и противовирусный Б. интерферон.

 

По составу белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеиды) или пигмент (хромопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеиды), углевода (гликопротеины)или нуклеиновой кислоты (геномы некоторых вирусов). В соответствии с формой молекул белков подразделяют на глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свернуты в компактные глобулы сферич. или эллипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна (фибриллы) и высокоасимметричны. Большинство глобулярных белков, в отличие от фибриллярных, растворимы в воде. Особую группу составляют мембранные (амфипатические) белки, характеризующиеся неравномерным распределением гидрофильных и гидрофобных (липофильных) участков в молекуле: погруженная в биол. мембрану часть глобулы состоит преим. из липофильных аминокислотных остатков, а выступающая из мембраны - из гидрофильных.

 

 

ХРОМАТОГРАФИЯ - это метод разделения, анализа и физ.-хим. исследования в-в. Обычно основана на распределении исследуемого в-ва между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент).

 Неподвижная  фаза гл. обр. представляет собой  сорбент с развитой пов-стью, а подвижная - поток газа (пара, флюида -в-во в сверхкритич. состоянии) или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.

Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

 В  результате происходит разделение  анализируемых веществ и их  концентрирование в строго определенном  слое адсорбента. Затем через  колонку пропускают подходящие  элюенты, которые ослабляют силы  адсорбции и выносят с током  раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают  в коллекторе фракций (принцип  сорбции-десорбции).

Основные виды хроматографии

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую, флюидную (или сверхкритич. хроматографию с флюидом в качестве элюента; см. Капиллярная хроматография)и жидкостную хроматографию. В качестве неподвижной фазы используют твердые (или твердообразные) тела и жидкости. В соответствии с агрегатным состоянием подвижной и неподвижной фаз различают следующие виды хроматографии:

1) газо-твердофазную  хроматографию, или газоадсорбционную хроматографию; 2) газо-жидкостную хроматографию (газо-жидко-твердофазную);

3) жидко-твердофазную  хроматографию;

4) жидко-жидкофазную  хроматографию;

5) флюидно-твердофазную хроматографию;

6) флюидно-жидко-твердофазную хроматографию.

 Строго  говоря, газо-жидкостная хроматография  пока не реализована, на практике  используют только газо-жидко-твердо-фазную  хроматографию (см. Газовая хроматография). Жидко-жидкофазная хроматография реализована, однако преим. используют жидко-жидко-твердо-фазную хроматографию (неподвижной фазой служит твердый носитель с нанесенной на его пов-сть жидкостью; см. Жидкостная хроматография).

По механизму разделения в-в различают:

адсорбционную,

распределительную,

ионообменную, э

ксклюзионную,

аффинную (биоспецифическую),

осадочную хроматографию.

 На  практике часто реализуется одновременно  неск. механизмов разделения (напр., адсорбционно-распределителъный, адсорбционно-эксклюзионный и т. д.).

 По  геометрии сорбционного слоя  неподвижной фазы различают колоночную  и плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тонкослойная хроматография и бумажная хроматография. В колоночной хроматографии обычно выделяют капиллярную хроматографию, в к-рой сорбент расположен на внутр. стенках колонки, а центр, часть колонки остается незаполненной сорбентом, т.е. открытой для потока элюента (хроматография на открытых капиллярных колонках).

В зависимости от способа ввода пробы и способа перемещения хроматографич. зон по слою сорбента различают след. варианты хроматографии:

проявительный (или элюентный),

фронтальный

вытеснительный.

 В  наиб. часто используемом проявительном варианте анализируемую смесь периодически импульсно вводят в поток подвижной фазы; в колонке анализируемая смесь разделяется на отдельные компоненты, между к-рыми находятся зоны подвижной фазы.

 Во  фронтальном варианте хроматографии  пробу, содержащую разделяемые в-ва, непрерывно подают в колонку. Можно также подавать в колонку одновременно пробу и подвижную фазу. Во фронтальной хроматографии только первый, наименее сорбируемый компонент можно получить в чистом виде на выходе из колонки, вторая и последующая зоны содержат по два и более компонентов разделяемой смеси.

 В  вытеснительном варианте хроматографии в колонку после подачи разделяемой смеси вводят спец. в-во (т. наз. вытеснитель), к-рое сорбируется лучше любого из разделяемых компонентов. В вытеснительной хроматографии образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых в-в. Во фронтальном и вытеснительном вариантах хроматографии необходима регенерация колонки перед след. опытом.

 

Основы хроматографич. процесса.

 

 Для  проведения хроматографич. разделения в-в или определения их физ.-хим. характеристик обычно используют спец. приборы - хроматографы. Осн. узлы хроматографа - хроматографич. колонка, детектор, а также устройство для ввода пробы. Колонка, содержащая сорбент, выполняет ф-цию разделения анализируемой смеси на составные компоненты, а детектор -ф-цию их количеств. определения. Детектор, расположенный на выходе из колонки, автоматически непрерывно определяет концентрацию разделяемых соед. в потоке подвижной фазы.

 После  ввода анализируемой смеси с  потоком подвижной фазы в колонку  зоны всех в-в расположены в начале хроматографич. колонки. Под действием потока подвижной фазы компоненты смеси начинают перемещаться вдоль колонки с разл. скоростями, величины к-рых обратно пропорциональны коэффициентам распределения К (или константам распределения) хроматографируемых компонентов. Хорошо сорбируемые в-ва, значения констант распределения для к-рых велики, передвигаются вдоль слоя сорбента по колонке медленнее, чем плохо сорбируемые. Поэтому быстрее всех из колонки выходит компонент А, затем компонент Б и последним покидает колонку компонент В (КА<КБ<КВ). Сигнал детектора, величина к-рого пропорциональна концентрации определяемого в-ва в потоке элюента, автоматически непрерывно записывается и регистрируется (напр., на диаграммной ленте). Полученная хроматограмма отражает расположение хроматографич. зон на слое сорбента или в потоке подвижной фазы во времени.

____________________________________________________________________

 

 

 Чрезвычайно  эффективным средством фракционирования  белков из смеси оказалась  колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами  и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

 Адсорбционная  хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

 Рис. 1.3. Абсорбционнаяхроматография (схема). Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.  1 - нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 - окончание опыта.

 компоненты  разделяемой смеси адсорбируются  на адсорбенте. Затем приступают  к стадии освобождения – десорбции  компонентов из колонки, применяя  подходящие элюенты. Сбор фракций  осуществляют при помощи автоматического  коллектора фракций.

 Распределительная  хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

 Разновидностью  распределительной хроматографии  является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических  лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот  и других веществ. В качестве  стационарной фазы при этом  служит вода, адсорбированная целлюлозными  цепями фильтровальной бумаги. Образец  помещают на одном конце бумажной  полосы, этим же концом бумагу  погружают в подходящую смесь  органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

 

 

 Рис. 1.4. Хроматография на бумаге (схема).

 А  – восходящая хроматография; Б  – нисходящая хроматография (вид  сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

 Ионообменная  хроматография. Ионообменные смолы  являются полимерными органическими  соединениями, содержащими функциональные  группы, способные вовлекаться в  ионный обмен. Различают положительно  заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие функциональные группы:

 Аналогичные  функциональные группы содержат  триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

 Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующие функциональные группы:

 В  зависимости от заряда разделяемых  белков используют подходящую  ионообменную смолу, с функциональными  группами которой обменивается  и задерживается на колонке  часть белков, в то время как  другие белки беспрепятственно  элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.