Хитозан

Таким образом, доставка с использованием хитозанового полимера различных терапевтических  агентов может стать одним  из эффективных инструментов в лечении аллергических проявлений.

Применение  хитозана в качестве ДНК-вектора:

Благодаря поликатионной природе хитозанспособен  образовывать с отрицательно заряженными полимерами, такими как нуклеиновые кислоты, полиэлектролитные комплексы [30, 31]. Поэтому хитозан может быть использован для конструирования ДНК-содержащих носителей с целью получения генетически модифицированных клеток. Трансфекцияэукариотических клеток является мощным инструментом целенаправленного изменения генома и одновременно одним из самых больших достижений молекулярной и клеточной биологии последнего времени, открывающий неограниченные возможности в медицине в виде генной терапии.

В настоящее  время развиваются несколько  подходов к созданию эффективных  инструментов доставки ДНК в клетку. Среди них использование катионных  липосом, а также адено- и ретровирусов. В качестве перспективного инструмента для доставки ДНК в клетку рассматриваются полимерные системы, в том числе наночастицы и нанокапсулы [15].

Для трансфекции  клеток плазмидной ДНК используются рН-чувствительные липосомы. В кислых условиях они способны связывать  генетический материал и проникать  в клетку, а при изменении рН — сливаться с мембраной эндосомы, освобождая ДНК. Однако их использование имеет ряд недостатков, таких как высокая стоимость, иммуногенность, а также возможность агрегации липосом.

Использование вирусов в качестве носителей  ДНК обеспечивают хорошую эффективность трансфекции. И хотя большинство медицинских протоколов в настоящее время базируется именно на вирусных ДНК-векторах, использование таких систем ограничено по некоторым причинам: возможны их онкогенные свойства; ограниченное количество генетического материала, которое можно доставить с помощью вируса; необходимостью соблюдения правил общей биобезопасности при производстве вирусов.

Хитозан является перспективным кандидатом для конструирования носителей  ДНК-векторов, поскольку созданные  на его основе системы доставки с  внедренными в них ДНК-векторами имеют несколько преимуществ перед всеми рассмотренными выше: на их поверхности можно ковалентно присоединить лиганды, которые обеспечивают высокоспецифическое взаимодействие с клеточными рецепторами; можно ввести в клетку не одну, а несколько ДНК-плазмид в одной наночастице или нанокапсуле; можно защитить нуклеиновую кислоту от расщепления ферментами; ДНК-плазмиды приобретают компактный вид, что предотвращает их механический разрыв и облегчает проникновение через мембраны клеток; такие наночастицы можно лиофильно высушить и длительно хранить в такой форме без потери активности [15, 32].

Так, использование  хитозановыхнаночастиц в комплексе  с ДНК γ-интерферона, введенных  интраназально мышам, обеспечивало эффективную трансфекцию, что подтверждалось повышением уровня синтеза γ-интерферона  в эпителиальных клетках слизистой и в легочных моноцитах. Отмечен протекторный эффект в отношении метахолин-индуцированного бронхоспазма, предотвращалось увеличение количества эозинофилов и клеточная инфильтрация. Профилактическое введение комплекса способствовало повышению уровня продуцировании клетками селезенки γ-интерферона и уменьшению уровня ИЛ-4, ИЛ-5, а также уровня IgE в сыворотке. Показано, что основной мишенью для комплекса являются бронхиальныйэпителиум и макрофаги — два типа клеток, играющие важную роль в развитии астмы и иммуномодуляции [33]. Терапевтическое использование комплекса на мышах, сенсибилизированных овальбумином, предотвращало воспалительные процессы в слизистой бронхов через несколько часов после сенсибилизации аллергеном, и индуцировало апоптотические процессы у столбчатых клеток слизистой [34].

Доставка  гена γ-интерферона возможна и с  использованием аденовирусного вектора, однако такая система имеет некоторые  недостатки, прежде всего — это  отсутствие специфических для аденовируса рецепторов на апикальной части эпителиальных клеток, которые экспрессируются в основном на базолатеральной поверхности. В случае использования хитозановой матрицы, которая обладает хорошими мукоадгезивными свойствами, этот недостаток устраняется [35]. Так, использование комплекса на основе хитозана приводило к более резкому уменьшению эозинофилии по сравнению с аденовирусной доставкой, и хотя количество γ-интерферона было меньшим, терапевтический эффект был более выраженным, вероятно из-за более эффективной доставки ДНК хитозановым вектором в эпителиальные клетки [34]. Показано, что помимо назального и трансдермального, пероральное введение комплекса ДНК и хитозана может являться эффективным инструментом для доставки генов и их трансфекции в клетки кишечника [36].

Была  продемонстрирована эффективность  подобного вида доставки гена цитокина — трансформирующего фактора роста β1 (ТФР-β1), который выполняет определенную функцию в сдерживании аутоиммунных процессов. Кроме того, ТФР-β1 играет важную роль в индукции и поддержании пищевой толерантности посредством индукции секреции IgA и трансформации наивных Т-клеток в Т-регуляторы, которые остаются функционировать в кишечнике и супрессируютIgE ответ [37]. Комплекс хитозана с плазмидой, кодирующей ТФР-β1, перорально введенный мышам, обладал терапевтическим действием против пищевой аллергии. У мышей с искусственно вызванной пищевой аллергической реакцией введение комплексного средства приводило к нормализации состояния организма за счет повышения уровня экспрессии цитокина в клетках кишечника: происходило снижение уровня IL-4 и усиление синтеза ИФ-γ в Пейеровых бляшках тонкой кишки, понижался уровень специфического IgE в сыворотке. Действие комплекса сохранялось на протяжении как минимум двух недель после введения, тогда как применение нативного ТФР-β1 было кратковременным [38].

Для специфической  иммунотерапии также может быть применена трансформация клеток кишечника с пероральным введением генетического материал [39]. Так, пероральное введение гена арахисного аллергена Arah2 в комплексе с хитозаном оказывало профилактическое действие против пищевой аллергической реакции на этот аллерген. При этом повышения уровня специфического IgE не наблюдалось, но повышался уровень IgG2a в сыворотке, что говорит о Th₁-опосредованном иммунном ответе, а в кишечнике индуцировался синтез IgA, что свидетельствует о включении мукозального иммунного ответа. Нативная же ДНК без хитозана терапевтическим эффектом не обладала [40].

Аналогичным образом на мышиной модели продемонстрирована возможность специфической иммунотерапии против клещевого аллергена Derp1 из D. pteronyssinus [41]. Доставка ДНК, кодирующая аллерген клеща, в комплексе с хитозаном при пероральном введении вызывала повышение уровня специфических IgG2a, но не IgG1, что свидетельствует о Th1 пути иммунного ответа. Эффективность трансформации связывают с мукоадгезивными свойствами хитозана, что позволяет ему взаимодействовать с эпителиальными клетками кишечника с последующим захватом комплекса М-клетками, попаданием в Пейеровы бляшки и транспортировке до селезенки и лимфатических узлов, где в дальнейшем продуцируются специфические иммуноглобулины классов М и G. Кишечные эпителиальные клетки ворсинчатого эпителия тоже могут захватывать такой антигенный комплекс и осуществлять его представление [42]. Такие клетки имеют тесный контакт с интраэпителиальными лимфоцитами, являющимися специализированной популяцией Т-лимфоцитов, которые мигрируют из периферической крови в прослойку между базолатеральными мембранами эпителиальных клеток. Таким образом, возможно осуществление регуляции Т-клеточного ответа. Дендритные клетки, располагающиеся в различных местах кишечника, вероятно также могут захватывать комплекс или получать его от эпителиальных клеток с последующей миграцией к лимфоузлам, поставляя тем самым необходимый сигнал для созревания наивных Т-клеток [41].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выводы

 

На основании  полученных результатов можно сделать  вывод, что высокоочищеннныйхитозан существенно превосходит по своим свойствам первичный хитозан. Высокоочищенный хитозана характеризуется значительно более низким содержанием таких токсичных элементов как ртуть, мышьяк, свинец, кадмий, также уменьшилась массовая доля нерастворимых веществ. Уровень мутности растворов высокоочищенного хитозана меньше мутности первичного хитозана. Эти факты свидетельствует об эффективности предложенного метода очистки хитозана.

На основании  вышесказанного можно сделать вывод, что разработанная технология обеспечивает получение высокоочищенного хитозана высокого качества и из доступного сырья, который способенконкурировать на современном рынке, а также удовлетворять потребности потребителей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

Таким образом, возможность использования хитина и хитозана с терапевтической целью применительно к аллергическим заболеваниям как самостоятельно, так и в качестве матрицы для доставки лекарственных препаратов и ДНК расширяет спектр практического применения этих биополимеров. Возможность варьирования свойств этих биополимеров, в том числе и за счет получения на их основе различных производных, способна в перспективе дать еще более эффективные медицинские системы для лечения всевозможных заболеваний у человека.

 

 

Список используемой литературы

 

1. Куликов  С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Хайруллин  Р.З. Роль структуры в биологической активности хитозана. Вестник Казанского технологического университета 2007; 6: 10-15.

 

2. Куликов  С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Фассахов  Р.С. Хитин и хитиназы при  аллергических реакциях. Российский  Аллергологический Журнал 2009; 1: 18-23.

 

3. Ярилин  А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. с. 608.

 

4. Shibata Y., Foster L.A., Kurimoto M., et al. Immunoregulatory roles of IL-10 in innate immunity: IL-10 inhibits macrophage production of IFN-γ-inducing factors but enhances NK cell production of IFN-γ. J. Immunol. 1998; v. 161; 4283—4288.

 

5. Shibata Y., Foster L.A., Metzger W.J., Myrvik Q.N. Alveolar macrophage priming by intravenous administration of chitin particles, polymers of N-acetyl-D-glucosamine, in mice. Infect. Immun. 1997; v. 65: 1734—1741.

 

6. Shibata Y., Foster L.A., Bradfield J.F., Myrvik Q.N. Oral administration of chitin down-regulates serum IgE levels and lung eosinophilia in the allergic mouse. J. Immunol. 2000; v. 164: 1314—1321.

 

7. Ozdemir C., Yazi D., Aydogan M., et al. Treatment with chitin microparticles is protective against lung histopathology in a murine asthma model. Clin.Exp. Allergy 2006; v. 36: 960-968.

 

8. Chen C.L., Wang Y.M., Liu C.F., Wang J.Y. The effect of water-soluble chitosan on macrophage activation and the attenuation of mite allergen-induced airway inflammation.Biomaterials 2008; v. 29: 2173—2182.

 

9. Hauser C., Wuthrich B., Matter L. Staphylococcus aureus skin colonization in atopic dermatitis. Dermatologica. 1985; v. 170: 35-39.

 

10. Куликов  С.Н., Долбин Д.А., Тюрин Ю.А. Антибактериальные  свойства низкомолекулярного хитозана при атопическом дерматите. Российский Аллергологический Журнал 2008;1 (прил. 1): 146-147.

 

11. MoonJ.S., KimH.K., KooH.C. etal. The antibacterial and immunostimulative effect of chitosan-oligosaccharides against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. Appl. Microbiol. Biotechnol 2007; v. 75: 989 — 998.

 

12. Breuer K., Kapp A., Werfel T. Bacterial infections and atopic dermatitis. Allergy.2001; v. 56: 1034—1041.

 

13. Schlievert P.M. Chitosan malate inhibits growth and exotoxin production of toxic shock syndrome-inducing Staphylococcus aureus strains and group A streptococci. Antimicrob.AgentsChemother. 2007; v. 51: 9: 3056—3062.

 

14. Большаков  И.Н., Насибов С.М., Куклин Е.Ю., Приходько  А.А. Использование хитозана и  его продуктов при воспалительных  заболеваниях желудочно-кишечного  тракта. Хитин и хитозан: получение,  свойства и применение. М.: Изд-во  Наука, 2002. с. 280-301.

 

15. Марквичева  Е.А. Хитозан и его производные  в биоинкапсулировании. Хитин  и хитозан: получение, свойства  и применение. М.: Изд-во Наука, 2002. с. 315-326.

 

16. Koping-Hoggard M., Mel'nikova Y.S., Varum K.M., et al. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo. J. Gene Med. 2003; v. 5: 2: 130-141.

 

17. Hafner A., Filipovi-Gri J., Voinovich D., Jalsenjak I. Development and in vitro characterization of chitosan-based microspheres for nasal delivery of promethazine. Drug Develop. Industr. Pharm. 2007; v. 33; 427-436.

 

18. Kobayashi M., Nasuhara Y., Betsuyaku T., et al. Effect of low-dose theophyllin on airway inflammation in COPD. Respirology.2004; v. 9: 249-254.

 

19. Lee D.W., Powers K., Baney R. Physicochemical properties and blood compatibility of acylated chitosan nanoparticles. Carbohydrate Polymers 2004; v. 586: 371-377.

 

20. Bernkop-Schnurch A., Hornof M., Zoidl T. Thiolated polymers-thiomers: synthesis and in vitro evaluation of chitosan-2-iminothiolane conjugates. Int. J. Pharm. 2003; v. 260: 229-237.

 

21. Kast C.E., Valenta C., Leopold M., Bernkop-Schnurch A. Design and in vitro evaluation of a novel bioadhesive vaginal drug delivery system for clotrimazole. J. Control. Release 2002; v. 81: 347-354.

 

22. Fernandez-Urrusuno R., Romani D., Calvo P., et al. Development of a freeze-dried formulation of insulin-loaded chitosan nanoparticles intended for nasal administration. Stp. Pharma.Sciences 1999; v. 9: 429-436.

 

23. Martinac A., Filipovic-Grcic J., Perissutti B., et al. Spray-dried chitosan/ethylcellulose microspheres for nasal drug delivery: swelling study and evaluation of in vitro drug release properties. J. Microencapsul. 2005; v. 22: 5: 549-561.

 

24. Astori M., von Garnier C., Kettner A., et al. Inducig tolerance by intranasal administration of long peptides in naive and primed CBA/J mice. J. Immunol. 2000; v. 165: 3497—3505.

 

25. Hall G., Lund L., Lamb J.R., Jarman E.R. Kinetics and mode of peptide delivery via the respiratory mucosa determine the outcome of activation versus Th2 immunity in allergic inflammation of the airways. J. Allergy. Clin.Immunol.2002; v. 110: 883-890.

 

26. Langenkamp A., Messi M., Lanzavecchia A., Sallusto F. Kinetics of dendric cell activation: impact of priming of Th1, Th2 and nonpolarised T cells. Nat. Immunol. 2000; v. 1: 311-316.

 

27. Kim S.T., Kim C.K. Water-soluble chitosan based antisense oligodeoxynucleotide of interleukin-5 for treatment of allergic rhinitis. Biomaterials 2007; v. 28: 3360—3368.

 

28. Mohapatra S.S., Lockey R.F., Vesely D.L., Gower W.R. Natriuretic peptides and genesis of asthma: an emerging paradigm? J. Allergy Clin. Immunol.2004; v. 114: 520-526.

 

29. Wang X., Xu W., Mohapatra S., et al. Prevention of airway inflammation with topical cream containing imiquimod and small interfering RNA for natriuretic peptide receptor. Genet.Vaccin.Therapy.2008; v. 6: 7: 15-23.

 

30. Ильина  А.В., Варламов В.П. Полиэлектролитные  комплексы на основе хитозана. ПрикладнаяБиохимия и Микробиология 2005; т. 41: 1: 9-16.

 

31. Danielsen S., Varum K.M., Stokke B.T. Structural analysis of chitosan mediated DNA condensation by AFM: influence of chitosan molecular parameters. Biomacromolecules 2004; v. 5: 928-936.