Хитозан

В настоящем  обзоре рассматриваются аспекты  применения хитина и хитозана в терапевтических  целях при аллергических заболеваниях: описывается противоаллергическая активность самих биополимеров и вызываемые ими биохимические реакции в живом организме, а также перспективы использования хитозана в качестве носителя лекарственных средств, используемых при патогенетической терапии с целью повышения их фармакологической активности в лечении и профилактики различных форм аллeргической патологии.

Применение  хитина против аллергических заболеваний

Воспалительные  процессы при аллергических реакциях сопровождаются участием Th₂-клеток, которые выделяют соответствующие цитокины, а также способствуют образованию иммуноглобулинов классов Е и G₁. Одним из способов предотвращения аллергического процесса, опосредуемого Th₂-клетками, является активизация CD₄±клеток типа Th₁. Th₁-клетки супрессируютIgE-ответ и подавляют дифференцировку Th₂-клеток и секрецию ими ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10. Эта активность Th₁-клеток связана в основном с ИФ-γ, обладающего действием, противоположным влиянию ИЛ-10. В связи с этим, любые факторы, способствующие дифференцировке Th₁-клеток, автоматически ингибируют развитие Th₂-клеток и аллергических реакций [2, 3].

При участии Th₁-клеток осуществляется иммунный ответ организма на присутствие клеток бактерий [4]. Имитируя бактериальные клетки, Y. Shibata с соавторами попытались использовать микрочастицы хитина различного размера для активации Th₁-опосредованного иммунного ответа с целью предотвращения аллергических проявлений у мышей, сенсибилизированных аллергеном [4-6]. Было показано, что пероральное и интраназальное введение микрочастиц хитина размером 1-20 мкм может оказывать профилактический и терапевтический эффект. При этом отмечалось снижение уровня ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10 в клетках селезенки, сывороточного IgE, тканевой инфильтрации эозинофилами тканей легких [4-6]. Гистологические исследования легких мышей, которые были подвергнуты действию аллергенов, также подтвердило эффективность профилактического и терапевтического действий хитиновых микрочастиц — при действии аллергена в ткани легких развивалась воспалительная клеточная реакция, а использование частиц хитина значительно уменьшало выраженность воспаления, и структура тканей была близка к здоровой, что выражалось в сокращении количества столбчатых секреторных клеток эпителия, выстилающих слизистые оболочки дыхательных путей, сохранении исходных размеров и морфологии эпителиального слоя, базальной мембраны и субэпителиального слоя гладких мышц [6, 7].

Способностью  индуцировать в клетках селезенки  мышей ИФ-γ обладали только те микрочастицы хитина, которые могли быть поглощены  фагоцитами. Дисперсный хитин и хитиновые  микрочастицы размером более 50 мкм, макрофагами  не фагоцитируемые, подобной активностью не обладали [5]. Способность микрочастиц хитина активировать макрофаги ингибировалось, если эти частицы были покрыты маннаном или маннан был добавлен в среду. Таким образом, в распознавании микрочастиц хитина, возможно, играют ключевую роль расположенные на поверхности макрофагов маннозные рецепторы, и суперсемействоToll-подобных рецепторных белков, через которые и поступает сигнал на усиление синтеза ИФ-γ и других цитокинов, характерных для Th₁-опосредованного иммунного ответа.

Применение  хитозанапри аллергических заболеваний

В последнее  время противоаллергические свойства были обнаружены и у хитозана — деацетилированного производного хитина. Противоаллергический эффект хитозанового полимера связывают с его действием на макрофаги [8]. Отмечено, что у больных с атопической бронхиальной астмой при контакте с аллергеном макрофаги образуют на поверхности клеток большое количество микропсевдоподий. При действии хитозана морфология макрофагов не изменялась и образование псевдоподий не происходило. Было показано, что хитозан способен ингибировать в макрофагальных клетках каскад реакций, который активируется протеинкиназой-Сζ при действии аллергена. Деактивация хитозаномпротеинкиназы-Сζ уменьшает гиперфосфорилирование и последующую деградацию ингибитора фактора транскрипции NK-κB, который связывается со специфической  в энхансере гена каппа легкой цепи иммуноглобулина в B-клетках, а также взаимодействует с регуляторными участками генов и активирует транскрипцию определенных групп генов, в том числе провоспалительных медиаторов [8].

Определенную  роль в предотвращении аллергических  реакций могут выполнять также антибактериальные и сорбционные свойства хитозана. Так, у больных атопическим дерматитом присоединение бактериальной инфекции кожи наблюдается более чем в 30% случаев. Лидирующим этиологическим микробным агентом, инфицирующим кожу при этом заболевании, является золотистый стафилококк [9]. Это позволяет рассматривать хитозан как перспективный антимикробный агент для местной терапии кожных инфекций стафилококковой этиологии [10, 11].

Развитие  атопической экземы у пациентов, инфицированных S. aureus, во многом определяется способностью этого вида бактерии продуцировать широкий спектр токсинов и суперантигенов, которые могут вызывать и поддерживать воспалительную реакцию в дерме [12]. Имеются данные, что хитозан на уровне регуляции генов ингибирует продуцирование стафилококками таких токсинов, как TSST-1, энтеротоксинов В и С, дельта-гемолизина [13]. Другим способом элиминации токсинов может быть их сорбция хитозановым полимером по аналогии со связыванием эндотоксина грамотрицательных бактерий, эффективность которого была продемонстрирована в модельных опытах на животных [14].

Таким образом, антимикробные и сорбционные  свойства хитозанового полимера дают возможность использовать этот полимер в качестве компонента присыпок, гелей и мазевых форм при местном применении на инфицированных участках кожи при атопической патологии.

4. Применение хитозана в качестве матрицы для доставки лекарственных средств:

В последнее  время проводятся интенсивные исследования по возможности использования хитозана в качестве полимерной матрицы для доставки лекарственных веществ с пролонгированным высвобождением, поскольку большинство веществ сами по себе характеризуются низкой проникающей способностью через биологические мембраны [15, 16]. Кроме того, многие используемые в настоящее время лекарственные средства, несмотря на безусловную эффективность при лечении того или иного заболевания, вызывают нежелательные побочные эффекты. Совершенная лекарственная система должна осуществлять доставку лекарственного вещества в больной орган и его высвобождение в нужный момент и в минимальном количестве, необходимом для достижения терапевтического эффекта. Создание такой системы позволило бы существенно снизить дозы лекарственных веществ и, следовательно, избежать их побочных реакций.

Традиционные  способы введения лекарств — назальный  и пероральный — позволяют избежать связанных с парентеральным путем введения риска инфицирования и болевых реакций. Скорость выделения контролируется количеством лекарства в матрице, растворимостью его в полимере, степенью гидратации геля, кинетикой набухания-обезвоживания полимера. Скорость сорбции и десорбции можно направленно менять путем введения в гель лигандов, способных специфически связываться с сорбируемым веществом.

В настоящее  время известны примеры успешного  использования целого ряда полимерных систем на основе хитозана для доставки и контролируемого освобождения веществ через слизистые и, в частности, при их назальном и пероральном введениях [17]. Основные требования к лекарственной форме, предназначенной для назального и перорального приема, следующие: обеспечение защиты доставляемого вещества от деградирующего действия ферментов и кислой среды желудка (при пероральном ведении), наличие повышенной мукоадгезивной активности к поверхностным компонентам слизистых оболочек, контролируемое высвобождение лекарства (для перорального введения — в нейтральной среде тонкого кишечника или прямой кишки).

Так, теофиллин  — гетероциклический алкалоид растительного  происхождения, действие которого основано на расслаблении бронхиальной гладкой  мускулатуры, но применение которого вызывает затруднение необходимостью точного  соблюдения дозировки, поскольку ее превышение может привести к побочным эффектам, например, сердечной аритмии, головной боли и тошноте, в результате чего в настоящее время все более распространенными становятся ингаляционные глюкокортикоиды. Кроме того, теофиллин супрессирует активацию нейтофилов и эозинофилов в концентрации меньшей, чем требуется для бронхорелаксации [18]. Для уменьшения побочных эффектов и увеличения эффективности терапевтического действия теофиллина было предложено осуществлять применение алкалоида в составе хитозановых микрочастиц. Посредством назального способа введения такого комплекса мышам, сенсибилизированных овальбумином, было достигнуто уменьшение легочного воспаления, патологических изменений в структуре эпителия, гиперплазии столбчатых клеток и гиперсекреции ими слизи. Отмечено увеличение апоптотических клеток в тканях воздухоносных путей [19].

У действующего вещества, введенного назально, для  проникновения в слизистую носового прохода время ограничено из-за постоянной ее самоочистки. Для того чтобы действующие вещества оставались на слизистой дольше, они могут быть включены в состав комплекса, один из компонентов которого обладает высокой мукоадгезивной активностью. Такой комплекс будет адгезироваться на слизистой на более длительный промежуток времени, обеспечивая пролонгированное высвобождение лекарственного средства.

Хитозан обладает хорошеймукоадгезивностью благодаря  своим многочисленным аминогруппам, которые могут взаимодействовать с остатками сиаловой и сульфоновой кислот на поверхностях слизистых [19]. Повышение мукоадгезивной активности хитозана можно достичь путем введение в состав полимера тиоловых групп, которые, как полагают, образуют дисульфидные связи с цистеин-содержащими субдоменамимуциновых гликопротеидов [20, 21]. Благодаря этому, микрочастицы на основе тиолированногохитозана были более эффективны в доставке теофиллина по сравнению с микрочастицами из немодифицированного полимера [19]. Кроме того, хитозан увеличивает эпителиальную проницаемость за счет ослабления связи между эпителиальными клетками [22].

Была  продемонстрирована доставка противоаллергических веществ в составе более сложных  комплексов, где этилцеллюлозное  ядро микрочастицы выполняло роль носителя лекарственного средства — лоратадина, а хитозановая оболочка обеспечивала мукоадгезивные свойства комплекса [23]. Эффективность доставки с помощью  микрочастиц с аналогичной структурой была показана и для другого противоаллергического вещества — прометазина [17]. Следует отметить, что варьирование количественного соотношения этилцеллюлозы и хитозана в составе микрочастиц влияло на уровень их загрузки доставляемым веществом, степень их максимальной гидратации и набухания, что определяло кинетику высвобождения лекарственного компонента из комплекса и делало этот процесс контролируемым.

Использовать  хитозан как матрицу можно  и для специфической иммунотерапии  с использованием аллергенов. Поскольку  периферийная Т-клеточная толерантность  может быть индуцирована посредством  доставки растворимого антигена через  мукозальную слизистую [24], но специфическая иммунотерапия, в некоторых случаях очень эффективная, может иногда стать причиной серьезных осложнений из-за IgE-опосредовнной активации эффекторных клеток, поэтому было предложено вводить аллерген в составе комплекса с хитозаном [25]. Этим обеспечивалась как эффективность доставки вещества через слизистые оболочки, так и возможность контролировать длительность высвобождения и количество поступающего в организм аллергена. Контроль этих параметров очень важен, поскольку они определяют кинетику активации антиген-презентирующих клеток (АПК) [26], влияя на количество и аффинности МНС-пептидного комплекса, экспрессию совместно стимулирующихся молекул и цитокинов, которые продуцируются во время презентации АПК Т-клеткам, по разному регулирующие индукцию Th1- и Th2-ответов [25].

Было  показано, что назальное введение мышам пептида, являющегося иммунодоменантнымэпитопом Derp1-аллергена из Dermatophagoidespteronyssinus, в комплексе с хитозаном способствовало снижению продукции спленоцитами IL-5 и IL-13. У сенсибилизированных мышей комплекс пептида и хитозана уменьшал эозинофилию легких, содержание в них IL-4 и IL-5, в то время как антиген введенный сам по себе в том же количестве никакого эффекта не оказывал [25].

Практически все биохимические процессы, протекающие  в организме, определяются экспрессией генетического аппарата клеток. При аллергических реакциях уровень экспрессии некоторых генов изменяется в нежелательном направлении. Так, повышается уровень синтеза некоторых цитокинов, например, ИЛ-5, чему предшествует транскрипция соответствующего гена и образование мРНК. Ингибировать синтез ИЛ-5 можно с помощью введения в клетку антисмысловых олигомеров нуклеиновых кислот, которые благодаря комплементарности будут специфически блокировать трансляцию с мРНК данного цитокина. Таким образом, будет остановлен каскад нежелательных реакций, запуск которого определяется повышенной концентрацией в клетках и тканях ИЛ-5. Однако применение подобных антисмысловыхполинуклеотидов в экспериментах с моделированием аллергического ринита на мышах был неэффективен, поскольку нативные олигомеры подвергались быстрому ферментативному расщеплению. Использование олигомеров в комплексе с хитозаном при назальном введении мышам обеспечивало терапевтическое действие. В клетках слизистых воздухоносных путей происходило уменьшение синтеза ИЛ-5, а уровень IgE в сыворотке оставался на уровне нормы. Сами слизистые у мышей, которым вводили комплекс, сохраняли нормальный вид по сравнению с таковыми у мышей, у которых аллергический ринит не подвергался терапии либо которым были введены нативные олигомеры [27].

В составе  комплекса с хитозаном была продемонстрирована эффективность трансдермальной  доставки siRNA рецептора натриуретического  пептида. Натриуретический пептид является белком, ассоциированным с аллергическими проявлениями, который связывается со своими рецепторами, расположенными на поверхности различных клеток, активируя внутриклеточнуюгуанилат-циклазу и образование цГМФ, что ведет к активации соответствующих протеинкиназ и изменению работы мембранных ионных каналов, приводящей в итоге к запуску некоторых клеточных процессов, участвующих в воспалительной реакции [28]. Введение в ткани siRNA приводило к умолканию гена рецептора натриуретического пептида, что в итоге способствовало не только уменьшению аллергических воспалительных процессов, но на ранних этапах терапии предотвращало переключение иммунной системы в сторону Th2-ответа. Использование нативнойsiRNA было неэффективным, по всей видимости, из-за расщепления молекул нуклеазами [29].