Биотехнологическое производство витамина В12

Для медицинских целей  субстанцию витамина получают в виде кристаллического темно-красного порошка, содержащего не менее 99 % основного вещества. Из субстанции готовят различные лекарственные формы: растворы для инъекций и таблетки.

Активно продуцируют витамин представители рода Propionibacterium, природные штаммы которых образуют от 1,0 до 8,5 мг/л витамина, а полученный искусственный мутант Р. Shermanü М-82 способен накапливать витамин до 58 мг/л.

Практический интерес  для микробиологического синтеза имеют представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Витамин И значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л). Представители рода Micromonospora

    Для медицинских  целей субстанцию витамина получают в виде кристаллического темно-красного порошка, содержащего не менее 99 % основного вещества. Из субстанции готовят различные лекарственные формы: растворы для инъекций и таблетки.

Активно продуцируют витамин представители рода Propionibacterium, природные штаммы которых образуют от 1,0 до 8,5 мг/л витамина, а полученный искусственный мутант Р. Shermanü М-82 способен накапливать витамин до 58 мг/л.

Практический интерес  для микробиологического синтеза имеют представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Витамин значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л). Представители рода Micromonospora. Высокой кобаломинсиитезирующей активностью обладают метагенные бактерии, например, Mtthanosarcina barkeri, М. Vacuolita и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л).

Витамин синтезируют строго анаэробные бактерии из рода кло-стридий. В значительных количествах образуют витамин ацетогенные клостридии С. Thermoaceticum* С. Formicoaceticwn и Acetobacter woodi,

Некоторые штаммы Pseudomonas denitrificans нашли применение для промышленного получения цианокобаламина. Интерес представляют также термофильные бациллы, а именно, Bacillus eirculans, Bacillus stearothermophilus, которые растут при температурах, соответственно, 60 °С и 75 °С и за 18-24 часа культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокий выход витамина.

Например, в России в качестве основного продуцента витамина В12, получаемого для медицинских целей, используют культуру Propionibacterium shermanii. Для получения витамина               Р. shermanii культивируют периодическим методом в анаэробных стерильных условиях в питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония.

Образующиеся в процессе брожения органические кислоты нейтрализуют раствором щелочи, добавление которой регулируются автоматически. Через 72 часа культивирования в среду вносят предшественник биосинтеза - 5,6-диметилбензимидазол. Без введения предшественника бактерии синтезируют не имеющий клинического значения псевдовитамин. в котором азотистым основанием служит аденин. После введения предшественника ферментацию продолжают ещё 72 часа до содержания витамина в биомассе не менее 250 мкг/г.

Установлено, что основное накопление содержания витамина синтезируемое пропионовымы бактериями, выращенными на сывороточной среде, наблюдается кранней фазе логарифмического роста (до 72 часов инкубации)Количественное содержание витамина В,₂. продупирусмос Propionibacterium shermanii, устанавливают микробиологическим методом по зонам роста витаминзависимого штамма Е. Coli 133-3.

Витамин В и накапливается в клетках бактерий, поэтому по окончания процесса культивирования биомассу отфильтровывают или сепарируют и экстрагируют из нее витамин при температуре 85 ± 5 °С водой, подкисленной  до pH 4,5-5,0.

Затем водный экстракт витамина охлаждают, доводят раствором щелочи pH до 6,8-7,2; к раствору добавляют сульфат аммония и раствор хлорного железа для коагуляции белков. Коагулят белков, отделяют на фильтр-прессе, и водный экстракт витамина поступает на стадию выделения и очистки кристаллического продукта

Витамин В12 из водного экстракта, освобожденного от белков, сор-бируют на ионообменной смоле СГ-1 и элюируют водным раствором аммиака .Далее элюат пропускают через колонки с окисью алюминия, при этом витамин сорбируется на окиси алюминия, а примеси удаляются с маточным раствором.

С окиси алюминия элюируют водным ацетоном, к водно-ацетоновому элюату добавляют безводный ацетон до помутнения раствора и смесь выдерживают при температуре 3 ± 1 °С в течение 24—48 ч, при этом происходит кристаллизация витамина В12 Выделившиеся кристаллы технического витамина отфильтровывают, промывают безводным ацетоном, эфиром и сушат в вакууме.

Для химической очистки витамина используют его способность образовывать аддукты (комплексы) с фенолом, резорцином или крезолами. Для этого водный концентрат витамина обрабатывают водным раствором фенола, отделяют фильтрованием выделившийся комплекс, затем его разлагают путем обработки водным ацетоном. Витамин при этом выделяется я виде осадка, а фенол и примеси уходят с водно-ацетоновыми маточными растворами. Для окончательной очистки осуществляют одно- или двукратное переосаждение цианокобаламина из водного раствора ацетоном.

Необходимо отметить, что  штаммы пробиотиков кишечника человека и животных способны продуцировать цианокобаламин. Поддержание микрофлоры кишечника является гарантией обеспечения нашего организ-ма витамином. Так, например, Lactobacillus reuteri CRL 1098 предот-врашает побочные эффекты, вызванные дефицитом прК питании витамина Кроме того, обнаружено влияние содержания и типа аминокислот на продукцию витамина при культивировании Lactobacillus reuteri.

Биосинтез витамина В₁₂ :

Производство витамина В₁₂

В нашей стране в  качестве продуцента витамина В₁₂ используют Propionibacteriumf reudenreichii var. Shermanii Для получения витамина B₁₂бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник – 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин B₁₂(азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5-5,0 при 85-90 С в течение 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25%-ной NaNO₂. При получении Ko-B₁₂ стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина B₁₂ охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Аl₂(SO4)₃*18H₂Oи безводный FеСl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Al₂O₃. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом Ko-B₁₂ может быть отделен от CN- и оксикобала мина. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3-4°С 24-48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Для предотвращения разложения Ko-B₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом, можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом. Для химической очистки витамина B₁₂используется его способность образовывать продукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделение витамина B₁₂от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина B₁₂ с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат .

 

Применение витамина В₁₂

 

Для обогащения кисломолочных  продуктов витамином B₁₂ используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, таки в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Для нужд животноводства витамин B₁₂ получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии [1,4]. Установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метан образующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum, Mb. thermoautotrophicum при росте в присутствии H₂ и CO₂. Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0-6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина B₁₂-KMБ12. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0-2,5 %сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м³ СоСl₂ и 0,5% метанола как стимуляторы синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN=B₁₂и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80% от суммы всех корриноидов. Исходная барда имеет температуру около 100°С и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55-57°С. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное «метановое брожение» сточных вод. Получение концентрата витамина B₁₂включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке [1,4]. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года. Важное условие нормального процесса брожения – контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин B₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют – Cl до оптимального значения рН 5,0-5,3 и сульфит Na(оптимальное содержание 0,07-0,1%). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90–95°С при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.

Технологическая схема  представлена на рисунке. Ацетоно-бутиловая  барда из нижней части бражной  колонны поступает в сборник  барды и насосом подается в  декантатор 3. Отстой барды собирается в сборнике 4 и используется на корм скоту. Декантат, охлажденный до температуры 55-57°С, метанол и хлористый кобальт  поступают в ферментер 12. Сброшенную массу из верхней части ферментера отбирают и направляют в реактор 19, где осуществляют стабилизацию витамина B₁₂путем добавления сульфита натрия и соляной кислоты, смешанных в смесителе 18. Из стабилизированной бражки удаляют газы в сепараторе газов 22, бражку упаривают в выпарной установке 24 и собирают в сборниках 26. Сгущенная метановая бражка перекачивается насосом 27 в сборник метановой бражки 28, а от туда насосом 29 в распылительную сушилку 31. В качестве теплоносителя для сушки используют газы брожения, сжигаемые в печи 39. Сухой порошок поступает в бункер 33 и расфасовывается в полиэтиленовые мешки, вложенные в крафт-пакеты. Отсутствие промышленных отходов, доступность сырья, непрерывность метода, не требующего стерильных условий, делают его экономичным .

Украинским научно-исследовательским  институтом спиртовой и ликеро-водочной промышленности разработана технология получения кормового концентрата витамина B₁₂ путем сбраживания мелассно-спиртовой барды смешанной культурой метанообразующих бактерий. Предварительно на мелассно-спиртовой барде выращивают кормовые дрожжи. После сепарирования дрожжей получают культуральную жидкость, содержащую 7-8% сухих веществ. На этой жидкости выращивают метанообразующие бактерии и получают с 1 м³ исходной барды 1,5-2 г витамина В₁₂ [1].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов П 81 по спец. “Микробиология” и “Биология” / З.А.Аркадьева, А.М. Безбородов, И.Н.Блохина и ДР.; Под ред.. Н.С. Егорова. – М.:Высш. шк., 1989. – 688 с.: ил.
2. Н.А. Шмалько, И.И. Уварова, Ю.Ф. Осляков. Амарантовая мука – антиоксидантная добавка для макаронных изделий, обогащенных β–каротином // Пищевая технология. – 2004г. – №5–6. – стр. 39–41.
3. К.К. Полянский, Л.В. Голубева, О.И. Дол матова, Д.В. Дорохина. Изучение реологических свойств видов молочных консервов с β–каротином // Пищевая технология. – 2001г. – №1. – стр. 28–29.
4. Никтин Г.А. Биохимические основы микробиологических производств: Учеб. пособие. – Киев: Вища школа. Головное изд-во, 1981. – 312 с.
5. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Издательская фирма “Наука” СПБ 1995г. 600 стр. 166 ил.
6. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 123 с.

Читайте также статьи по теме "Производство витаминов":