Биотехнологическое производство витамина В12

Министерство образования,науки,молодежи и спорта

 

 

НТУ»ХПИ»

 

 

 

Курсовая работа

 

 

«Биотехнологическое производство витамина В12»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                                                     

Выполнила

Студ.гр.0-59б

Пильтенко М.И

Проверил:

Клещев Н.Ф

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Харьков 2012

Содержание

1.Вступление

2.Общие сведения  о витамине В12

3.Продуценты витамина  В12

4.Питательные среды

5.Биосинтез витамина  В12

6.Производство витамина

7.Применение витамина  В12

8.Технологическая  схема получения концентрата  витамина В12

9.Вывод

10.Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                              Введение

 

Витамины – группа низкомолекулярных органических веществ, которые в очень низких концентрациях оказывают сильное и разнообразное биологическое действие. В природе источником витаминов являются главным образом растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение

Принципы химического  строения витаминов настолько разнообразны, что классификация их на основе структуры  невозможна. Витамины делятся по принципу растворимости на жирорастворимые  и водорастворимые. Из жирорастворимых  витаминов наибольшее значение в  народном хозяйстве и в микробиологической промышленности имеют витамины групп  А и D, а из водорастворимых –  витамины В₂ и В₁₂ .Кроме того, микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу (при получении витамина С), а также для производства витаминных концентратов (витамина В₂, каротиноидов). Перспективно микробиологическое получение биотина, используемого в рационе кур и свиней. В настоящее время на Западе в большую часть комбикормов для свиней включают биотин, получаемый путем химического синтеза. В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь, а биологическая активностью обладает лишь D-форма витамина, которую синтезируют микроорганизмы .

 

Витамин    В12  активизирует обмен углеводов, белков и липилов. участвует в синтезе лабильных метильных групп, в образовании холина, метионина, нуклеиновых кислот, способствует накоплению в эритроцитах соединений с сульфгидрильными группами. Являясь фактором роста, стимулирует функцию костного мозга, что необходимо для нормобластного эритропоэза. Цианокобаламин способствует нормализации нарушенных функций печени и нервной системы, активизирует свертывающую систему крови, в высоких дозах вызывает повышение тромбопластической активности и активности протромбина.

В организме человека и  животных определенное количество циано-кобаламина синтезируется микрофлорой кишечника, что не удовлетворяет потребность  организма в витамине, и дополнительное количество его организм получает с продуктами питания.

Витамин В12 открыт в 1948 году одновременно в США и Англии, В 1972 году в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина . Химический синтез корнестерона (структурного элемента корринового кольца витамина), включаюший 37 стадий,крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

 

 

Витамин В12 –общие сведения

 

Витамин регулирует углеводный и липилный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований ,стимулирует образование предшественников гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т.п. Добавление витамина к кормам способствует более полноценному усвоению растительных белков и повышает продуктивность сельскохозяйственных животных на 10-15 %.

 

Среди неполимерных соединений витамин B₁₂ имеет самое сложное строение. Это α (5,6-диметилбензимидазол) – кобамидцианид:

В молекуле витамина B₁₂ различают:

1. Порфириноподобное,  хромофорное, или корриновое, кольцо, связанное с атомом кобальта  четырьмя координационными связями  через атомы азота.

2. Верхним координационным  лигандом кобальта в витамине B₁₂ является цианогруппа. Ее место могут занимать другие неорганические или органические заместители, например NO₂^2-, SO₂^2-, ОН^-, H₂O, CH₃, аденозил; заместители определяют название производных витамина B₁₂.

3. Шестая позиция  кобальта занята нуклеотидным  ядром (нижним лигандом кобальта), состоящим из азотистого основания,  рибозы и остатка фосфорной  кислоты. Нуклеотидное ядро связано  с кобальтом через азот основания,  а с корриновым кольцом через  аминопропаноловый мостик.

В составе витамина B₁₂ или цианкобаламина азотистое основание представлено 5,6-диметилбензимидазолом (5,6-ДМБ). Наличие 5,6-ДМБ определяет активность молекулы корриноидов (синоним названия витаминов группы B₁₂) для высших животных. Вместо 5,6-ДМБ микроорганизмы могут включать в молекулу другие бензимидазольные и пуриновые основания. Нуклеотидное ядро вообще может отсутствовать, как в случае фактора В.

Через 25 лет после  открытия витамина B₁₂ в 1972 г. в результате многолетних исследований был осуществлен полный химический синтез корриноидной структуры. Корриноид синтезирован в результате тридцати семи последовательных ступеней, но в силу сложности такого синтеза микробиологический метод остается пока единственным промышленным способом получения витамина B₁₂ .

 

Продуценты витамина B₁₂

 

В природе витамин B₁₂ и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина B₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Propionibacterium [1, 4, 5].Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0-8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант Р. shermaniiМ-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина [1,5]. В семействе Propioni bacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина B₁₂в клетках. Это, прежде всего Eubacterium limosum Butyribacterium rettgerii).Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardiarugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина B₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M.halophitica, M. fusса, M. chalceae. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например Methanosarcina barkeri, M. vacuolataи отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus [1, 4].Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridlum tetanomorphum и Cl. sticklandil аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образую витамин B₁₂ацетогенные клостридий Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂.

 

 Известны активне продуценты витамина B₁₂ у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 – мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Интерес представляют термофильные бациллы, а именно Bacillus circulans иВас. stearothermophilus, которые растут соответственно при 60 и 75 °С и за 18 ч. культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие (2,0-6,0 мг/л) выходы витамина. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas palustris, фототрофные пурпурные бактерииRhodobactersphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirillumrubrum, Chromatiumuinosumи ряд других видов. Значительные количества витамина B₁₂образует цианобактерии Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus 

 

Питательные среды

 

        Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, однако из 1 тонны печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина .Единственный способ его получения в настоящее время - микробиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного продукта при производстве антибиотиков в значительной степени стимулировало поиск организмов-продуцентов витамина и изучение путей его образования. Однако механизмы регуляции биосинтеза витамина до настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях витамин полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.

Продуцентами витамина при его промышленном получении служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезируюшие бактерии, одноклеточные водоросли. В 70-х годах XX века интерес ученых привлекли пропионовокислые бактерии, известные еще с 1906 года и широко использующиеся для приготовления препаратов в животноводстве. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12. Для получения нысокоочищенных препаратов витамина пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. Добавление в среду предшественника 5,6-диметилбензимидазола (способствует переводу неактивных форм в природный продукт) по окончании первой ростовой фазы (5-6 суток) стимулирует быстрый (18-24 ч) синтез витамина с выходом последнего 5,6-8,7 мг/л. Путем селекции, оптимизации состава среды  и условий культивирования выход витамина промышленных условиях был значительно повышен. Так, выход витамина на среде с кукурузным экстрактом  и  глюкозой при поддержании стабильного значения рН около Нейтрального достигает 21-23 мг/мл. Мутант пропионовокислой  бактерий продуцирует до 30 мг/мл витамина. Бактерии плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар-агар, крахмал) предотвращающих оседание бактерий, а также использование высоко анаэробных условий и автоматического поддержания рН позволяет получить наиболее высокий выход витамина - 58 мг/л.

Из культуральной жидкости витамин выделяют экстракцией, органическими растворителями, ионообменной хроматографией с последующим осаждением витамина из фракций в виде труднорастворимых соединений. В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогостоящие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых бактерий. Учитывая высокую светочувствительность витамина при проведении биотехнологического процесса необходимо все операции осуществлять в затемненных условиях или используя красный свет.

Для нужд животноводства сотрудниками института им. А. Н. Баха предложена простая и дешевая технология получения витамина . По указанной технологии ферментацию осуществляет сложный биоценоз термофильных микроорганизмов, производящих метановое брожение. Комплекс микроорганизмов включает целлюлозоразлагающие, углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфитвосстанавливающие и метан-образующие бактерии. На первой фазе процесса (10-12 дней) развиваются термофильные углевод сбраживающие и аммонифицирующие бактерии. При этом в слабокислой среде (рН 5,0-7,0) органические соединения превращаются в жирные кислоты и аммиак. На второй фазе, когда среду подщелачивают до рН 8,5; в биоценозе преобладают метан образующие бактерии, которые сбраживают возникающие на первой фазе продукты до метана и диоксида углерода. Именно метанобразующие бактерии - главные продуценты витамина. Обогащение сред очищенными культурами метанобразующих бактерий увеличивает выход активных форм витамина Источником углерода в   питательной среде служит ацетонобутиловая и спиртовая барда, которую поставляют заводы, перерабатывающие зерно и мелассу. Для оптимизации питательной среды в неб добавляют соединения кобальта (хлорид кобальта - 4 г/м ), который входит в состав молекулы витамина и субстраты для роста метанобразуюших бактерий - низшие жирные кислоты и низшие спирты, что позволяет значительно повысить выход витамина.

Подготовленное сырье  освобождают  в декантаторе от взвешенных частиц и непрерывно подают в нижнюю часть ферментера - емкость. Одновременно в ферментер поступает посевной материал культуры микроорганизмов, предварительно выращенной в специальных аппаратах. Для выращивания продуцента требуются облигатно анаэробные условия, так как даже следовые количества кислорода подавляют рост бактерий. При создании анаэробных условий в среду подают диоксид углерода газы, выделяющиеся в процессе ферментации. Ежедневно из ферментера отбирают 20-30 % объема среды. Продукт ферментации стабилизируют, подкисляя соляной или фосфорной кислотой до pH 6,3-6,5, а также добавляют 0,2-0,25 % сульфита натрия, что предотвращает разрушение витамина при тепловой обработке (особенно существенное в щелочной среде). В дальнейшем отобранная часть культуральной жидкости дегазируется, упаривается в вакууме; концентрат высушивается в распылительной сушке до влажности 10-15 % и смешивается с наполнителями.