Биологическая роль цинка

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Металлоферменты, содержащие в своем составе цинк

 

Карбоангидраза

Карбоангидраза была первым известным цинксодержащим металлоферментом. Фермент катализирует обратимую гидратацию диоксида углерода и поэтому важен для дыхания; кроме того, он катализирует гидролиз некоторых сложных эфиров и альдегидов.

Фермент содержит один атом цинка на моль и имеет молекулярную массу 30 000 (в нем примерно 260 аминокислотных остатков), изоэлектри-ческая точка металлофермента — 5,3. Молекула имеет эллипсоидную форму; ориентировочные размеры ее 4,0 х 4,5 х 5,5 нм; ион Zn2+, расположенный в глубоком кармане на расстоянии 1,2 нм от поверхности, связан с белковой молекулой очень прочно и может быть отделен только с помощью комплексообразователей. Один моль фермента при рН 7,3 и 0 °С катализирует образование 3,6 . 107 моль СО2 в минуту. Фермент, лишенный иона цинка, практически не обладает активностью, так как Zn2+ является важнейшим и незаменимым компонентом его активного центра (хотя в меньшей степени фермент может активироваться ионами Со2+, Fe2+, Ni2+ и Мn2+). Наиболее изучены карбоангидразы быка и человека. Фермент встречается в трех формах А, В и С, причем форма С в 30 раз более активна, чем форма В.

Кристаллическая структура  комплекса карбоангидраза В – имидазол предполагает, что имидазол связывается с цинком без вытеснения аквагруппы, давая пятикоординационный цинксодержащий комплекс [1].

Рипом и Янгом [2] были изучены ИК-спектр молекулы СО2, связанной в полости активного центра бычьей карбоангидразы.

Изучение ИК-спектров растворов карбоангидразы, уравновешенных со смесями СО2 и N2О, показывает, что обе молекулы конкурируют за активный центр, тем самым подтверждая, что СО2 не координирована с цинком.

 

Рис. 2. Схема гидратации СО2 в активном центре карбоангидразы

Рип и Янг изучили также влияние азид-иона на систему фермент – СО2 и сделали вывод, что гидрофобная полость находится рядом с ионом цинка, так что координированный азид-ион входит в полость, вытесняя СО2. Было найдено также, что бикарбонат-ион вытесняет обе молекулы – СО2 из полости и азид-ион от металла. Это означает, что бикарбонат-ион координирует с цинком через свой отрицательно заряженный кислород с сохранением молекулы в гидрофобной полости. Это заключение весьма важно. В реакции дегидратации перенос протона сопровождается разрывом С–О–связи, причем СО2 остается в полости, а ОН– координирует с цинком. В таком случае в реакции гидратации ион ОН– на цинке должен атаковать связанную СО2, превращая ее в НСО3– (рис.2).

Таким образом, карбоангидраза, которая катализирует обратимые процессы гидратации СО2 (в тканях) и дегидратации угольной кислоты (в легких), влияет на процесс дыхания и газообмен в организме. Карбоангидраза является первым из обнаруженных цинксодержащих ферментов и относится к числу наиболее изученных гидролитических ферментов. Она присутствует только в животных тканях: у позвоночных помимо эритроцитов она содержится в слизистой оболочке желудка, в поджелудочной и слюнной железах, в почках, хрусталике глаза. Один литр крови млекопитающих содержит 1–2 г этого фермента. Карбоангидразы действуют и в растениях, однако зачастую они не содержат металла.

Кроме освобождения организма от диоксида углерода, образующегося в процессе дыхания, карбоангидраза принимает участие в образовании хлороводородной кислоты в желудке, гидрокарбонатов слюны и поджелудочного сока. Она способствует десорбции воды в мочевых канальцах, играет большую роль в образовании скорлупы яиц в яйцепроводах птиц.

Три координационных места иона цинка заняты имидазольными группами гистидиновых остатков, а четвертое – или молекулой воды, или гидроксид-ионом, в зависимости от рН среды. В кристаллическом состоянии образуется пятикоординационный комплекс с участием еще одной имидазольной группы.

Механизм действия карбоангидразы в деталях пока еще не ясен. В частности, не решен окончательно вопрос, связывается ли СО2 с металлом. Схемы возможных процессов в активном центре фермента приведены на рис.3.

Карбоангидраза необратимо ингибируется ионами N3–, CN–, I–, HS–, сульфонамидами R– SO2– NH2, связывающимися непосредственно с ионом цинка. Особый случай представляет имидазол, действующий при гидратации СО2 как конкурентный ингибитор.

 

Рис. 3. Схемы возможных процессов в активном центре карбоангидразы: а и б – при рН>7,8; в и г – при рН<7,8.

 

Карбоксипептидаза

Карбоксипептидазы представляют собой цинксодержащие ферменты, которые образуются из своих неактивных предшественников или зимогенов (прокарбоксипептидаз) в поджелудочной железе животных и служат для переваривания белков. Карбоксипептидаза А существует в нескольких формах, зависящих от размера фрагмента, отрываемого от зимогена. Эти формы (табл. 3) имеют близкие свойства.

Таблица 3. Формы карбоксипептидазы

Фермент	Число аминокислотных остатков	N – концевой остаток
КПАα КПАβ КПАγ КПАδ	307 305 300 300	Аланин Серин Аспарагин »

 

Карбоксипептидаза катализирует реакции гидролиза пептидных связей:

 

превращая карбонильные группы пептидной связи субстрата в карбоксильные   . Одна из наиболее изученных форм этого фермента – карбоксипептидаза А, не гидролизующая белки и пептиды, в которых С–концевыми являются остатки аминокислот, имеющих дополнительные основные группы (аргинин, лизин, гистидин), а также пролина. Последние гидролизуются карбоксипептидазой В. Легче всего отщепляются С–концевые аминокислоты, имеющие ароматические или разветвленные алифатические заместители. Карбоксипептидазы А и В продуцируются в виде проферментов поджелудочной железой и активируются в двенадцатиперстной кишке трипсином.

Карбоксипептидаза А, выделенная из поджелудочной железы быка, представляет собой белок с молекулярной массой 34 600, который состоит из 307 аминокислотных остатков с остатками аспарагина в качестве С– и N–концевых аминокислот. Изоэлектрическая точка 6,0, оптимальная активность наблюдается при рН 7,5. Один моль белка присоединяет очень прочно один моль ионов Zn2+. При удалении ионов цинка фермент полностью утрачивает свою активность.

Она может быть восстановлена катионами других d-элементов, которые по способности активировать апофермент можно расположить в следующем порядке:

Со2+ > Ni2+ > Zn2+ > Mn2+ > Fe2+,

причем активность кобальтсодержащего фермента примерно в 2 раза выше, чем нативного (цинксодержащего).

Установлено, что молекулы карбоксипептидазы А имеют форму эллипса с размерами 5,0 х 4,2 х 3,8 нм.[3] Активный центр фермента имеет форму кармана, в углублении которого расположен ион Zn2+, связанный с остатками гистидина (His69 и His196) и глутаминовой кислоты (Glu72). Возможные процессы, происходящие в активном центре карбоксипептидазы, представлены на рис. 4.

Рис. 4. Расположение субстрата в активном центре карбоксипептидазы А

Четвертое координационное место занято молекулой воды, в результате чего окружение иона цинка представляет собой искаженный тетраэдр. При образовании фермент-субстратного комплекса молекула воды скорее всего вытесняется карбонильным кислородом гидролизующейся пептидной группировки. В состав активного центра входят также остатки глутаминовой кислоты (Glu270) тирозина (Tyr248) и аргинина (Argl45).[4] Последний служит для связывания С-концевой карбоксильной группы. Необходимо также отметить, что при связывании субстрата активный центр претерпевает конформационные изменения: за счет взаимодействия аргининового остатка с карбоксильной группой этот остаток приближается к субстрату. В свою очередь, это сказывается на белковой структуре таким образом, что фенольная группа Тyr248 перемещается на 1,2 нм с поворотом цепи. В результате она оказывается поблизости от расщепляемой пептидной группировки субстрата, что облегчает ее взаимодействие с атомом азота этой группировки и его протонирование. Взаимодействие карбоксильной группы Glu270 с карбонильным углеродом пептидной связи может ускорять общий основной катализ при атаке молекулы воды или при прямой нуклеофильной атаке на этот атом углерода.

Механизм действия карбоксипептидаз в организме до конца не ясен. На основании опытов in vitro предложены два возможных механизма:

— механизм «цинк – карбонил», предполагающий, что субстрат вытесняет молекулу воды, координированную цинком, с образованием затем связи карбонила субстрата непосредственно с ионом цинка;

— механизм «цинк – гидроксид», в основу которого положено взаимодействие иона цинка с группой ОН– или молекулой воды в зависимости от величины рН, которые образуют связь с карбонилом субстрата.

 

 

 

 

 

 

Рис. 5. Способы связывания пептидного субстрата с карбоксипептидазой.

Предпочтение отдается механизму «цинк–карбонил», схема которого и приведена на рис. 4.

Карбоксипептидазы А и В проявляют также эстеразную активность5.

Интересно, что замена иона Zn2+ в карбоксипептидазе на ионы Cd2+ или Hg2+ изменяет субстратную специфичность фермента, который полностью утрачивает пептидазную и приобретает эстеразную активность. По-видимому, этот эффект связан с изменением структуры активного центра.

При замещении Zn2+ на Hg2+ за счет удлинения связи М–L и ослабления ван-дер-ваальсовых взаимодействий ион металла смещается на 0,12 нм по сравнению с его положением в нативном ферменте, что приводит к удалению гидролизуемой пептидной связи от Glu270 и исчезновению пептидазной активности.

Кроме рассмотренных известна карбоксипептидаза С, отщепляющая от С-конца поли пептидной цепи остатки любых аминокислот. Она выделена из плодов и листьев растений семейства цитрусовых.

В плазме крови человека функционирует карбоксипептидаза N (оптимум активности фермента при рН 7,0), по субстратной специфичности сходная с карбоксипептидазой В. Она катализирует отщепление С–концевого аргинина от находящегося в крови брадикинина – пептида, понижающего кровяное давление.

К числу пептидаз, активируемых цинком, относятся термолизин и лейцинаминопептидаза.

Термолизин

Термолизин – эндопептидаза, выделенная из Bacillus thermoproteo-lyticus; имеет, как и карбоксипептидаза А, молекулярную массу 34 600 и содержит в составе молекулы один ион Zn2+. Особенностью этого фермента является высокая термостабильность, обусловленная наличием в его составе ионов Са2+. Координационное окружение иона цинка в нем сходно с окружением в карбоксипептидазе: его лиган-дами являются His142, His146, Glu166 и молекула воды. [5,6] При связывании пептидных субстратов последняя заменяется карбонильным кислородом гидролизуемой группировки. Гидролиз осуществляется по механизму «цинк – карбонил» с участием остатка Glu133 в качестве промотера атаки молекулы воды на карбонильный углерод субстрата (аналог Glu270 в карбоксипептидазе). Стерические затруднения мешают прямой нукле-офильной атаке этого остатка на карбонильный атом углерода. Расстояние между карбонильной группой и молекулой воды, связанной с карбоксилом Glu143, равно 0,35 нм. В отличие от карбоксипептидазы А термолизин не содержит в активном центре остатков тирозина (Туr248 в карбоксипептидазе), однако имидазол гистидина His231 может выполнять роль донора протона.[7]

Лейцинаминопептидаза

Лейцинаминопептидаза является экзопептидазой, катализирующей гидролиз пептидов, как это следует из ее названия, с N–конца, причем наилучшие субстраты для нее – пептиды, содержащие N–концевой лейцин, хотя этот фермент гидролизует пептиды с любым N–концевым аминокислотным остатком, кроме пролина. Фермент, выделенный из хрусталика глаза быка, имеет молекулярную массу 326 000 и состоит из 6 одинаковых субъединиц.[8] Каждая из них содержит по 2 иона Zn2+. Апо–фермент, лишенный этих ионов, не проявляет никакой каталитической активности. При замене Zn2+ на Мn2+ и Со2+ активность сохраняется.[9]

Существуют ферменты, участвующие в гидролизе дипептидов (ди-пептидазы), в состав которых обязательно входят ионы Zn2+.

Цинк входит также в состав других ферментов: эстераз, щелочной фосфатазы, а также дегидрогеназ, РНК- и ДНК-полимераз, супероксид-дисмутазы.

Щелочные фосфатазы

Щелочные фосфатазы, содержащиеся в лейкоцитах, катализируют гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты, проявляя кроме этого фосфотрансферазную активность. Фермент из Е. coli с молекулярной массой около 80 000 распадается при денатурации под действием кислот на две субъединицы и содержит 4 моль Zn2+ на моль фермента. Два иона обусловливают его каталитическую активность, а два других, по-видимому, необходимы для поддержания структуры. [10,11] Для проявления максимальной активности требуется также магний в количестве 2 моль Mg2+ на моль фермента. Таким образом, фермент может содержать максимум 6 металлических центров, причем ионы Mg2+ могут стабилизировать фермент только в присутствии ионов цинка. Предполагается, что в активных центрах ион Zn2+ связан с тремя гистидиновыми остатками; кроме того, лигандами могут быть остатки тирозина. Вероятно, в реакциях участвует промежуточный фосфофермент, образующийся скорее всего при фосфорилировании группы ОН– остатка серина (Ser99). Установлено, что в нормальных условиях действует механизм «флип-флоп», в соответствии с которым половина центров активна в любой момент времени, т. е. в этих условиях одна субъединица фосфорилируется, а другая связывает молекулу субстрата и фосфорилируется лишь после того, как первая субъединица освобождает фосфатную группу. Все это сопровождается значительными конформациоными изменениями апо–фермента. Фосфорилирование сразу обеих субъединиц возможно лишь при высоких концентрациях фосфат–ионов.

Следует остановиться еще на некоторых цинксодержащих ферментах.

Среди них – фруктозо–1,6–дифосфатаза. Фермент, выделенный из печени кролика, состоит из четырех субъединиц и связывает 8 ионов Zn2+. Фруктозо-1,6-дифосфатаза из печени крысы, также состоящая из четырех субъединиц, содержит 12 цинксвязывающих центров (по 3 на субъединицу). Причем в последнем случае связывание цинка с одной группой центров приводит к образованию активного фермента, а с другой — к его ингибированию, т. е. ион Zn2+ может действовать и как активатор, и как отрицательный аллостерический регулятор данного фермента.