Алкалойды спарыньи

В целом же химический синтез алкалоидов спорыньи начинается с алкилирования триптофана диметилаллилпирофосфатом, при этом атом углерода C₄ индольного ядра играет роль нуклеофила. Образовавшийся 4-диметилаллил-L-триптофан подвергается N-метилированию. Дальнейшими ступенями биосинтеза являются ханоклавин-I и агроклавин. Последний гидроксилируется до элимоклавина, который в свою очередь окисляется до паспаловой кислоты. В процессе аллильной перегруппировки паспаловая кислота преобразуется в лизергиновую кислоту, из которой могут быть получены различные эргоалкалоиды и их производные[7].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Однако, до настоящего времени наиболее выгодным методом является культивирование гриба на ржи. Ранее склероции собирали на пораженных в естественных условиях полях. В 30-40-е г.г. XX в. были разработаны методы искусственного разведения рожков на ржи. С этой целью озимая рожь высеивается ленточным способом на высоком агрофоне. При этом на одном квадратном метре должно быть не менее 500 колосоносных стеблей. Для заражения используют селекционные штаммы, которые отличаются более высоким и стабильным содержанием алкалоидов (эрготамина) в склероциях - 0,4-0,6% (в дикорастущих склероциях их содержание колеблется в пределах 0,027-0,24%).

Заражают рожь в начале колошения, когда на посевах в 50% растений из влагалищного листа появляется ость. В настоящее время делают инъекцию жидкости в верхнюю колосистую часть ржи. При этом инфицированная жидкость вместе со спорами из игл попадает на колоски ржи, где затем развивается плодовое тело маточных рожков. На тычинках злаков споры прорастают, образовывая грибницу - нитевидный мицелий. На зараженных грибом растениях через 1-2 недели начинают выделяться капли «медовой росы», где содержится большое количество конидиеспор. Конидиеспоры переносятся насекомыми на другие растения. В результате завязь атрофируется и образуется склероций. Для полного образования склероция необходимо 30-40 дней [4].

Маточные рожки собирают в период созревания, когда они приобретают буро-фиолетовую окраску. Рожки собирают ручным способом или путем прямого комбайнирования переоборудованными зерновыми комбайнами. При сборе ручным способом следует помнить об отравляющих свойствах алкалоидов и защищать лицо и руки. Урожай рожков составляет 50-100 кг/га, а в годы с благоприятными погодными условиями - до 150-200 кг/га. Рожки должны быть твердыми на ощупь и легко выниматься из колоса.

Сушат в сушилках при температуре около 50°С или в хорошо проветриваемом темном помещении. Процесс сушки заканчивают, когда рожки ломаются с легким треском. Предусматривается влажность не более 11 %, рожков в изломе желтых, побуревших - не более 5 %, раздробленных и ломаных рожков - не более 7 %, органических примесей - не более 1,5 %, минеральных - не более 0,5 %. Упаковывают в мешки по 30-40 кг. Хранят по списку Б [8].

Недостатками вышеописанного метода является получение только одного урожая склероциев в год и значительная зависимость от погодных условий. Поэтому уже давно предпринимались попытки освоения сапрофитной (лабораторной) культуры рожков для получения алкалоидов. При этом культуру гриба для получения эргоалкалоидов выращивают на искусственных питательных средах (сусло-агар, солод-агар, стерилизованные зерна ржи) в колбах в стерильных условиях. Через неделю после внесения в питательную среду чистой культуры маточных рожков появляется белый мицелий гриба. Для заражения посева мицелий вынимают из колбы, помещают на шелковое или капроновое сито и растирают с чистой водой. Потом инфицированную жидкость переносят на планшет-доску с иглами и войлоком, пропитывая его суспензией спор.

Основные трудности заключаются в том, что на искусственной питательной среде (в сапрофитной культуре) образуется мицелий, который продуцирует только конидиеспоры, последующие стадии развития гриба отсутствуют. а алкалоиды обычно синтезируются на стадии формирования паразитирующих склероциев. Первый патент на такой метод получен еще в 1910 г., но только в последние десятилетия в глубинной и поверхностной культуре рожков удалось получить достаточно высокий и стабильный выход алкалоидов клавиновой группы и простых производных лизергиновой кислоты. Из сапрофитной культуры этого гриба получают также паспаловую кислоту -- изомер (+)-лизергиновой кислоты. Эти соединения предложено преобразовывать в лизергиновую кислоту, из которой путем полусинтеза можно получить эрготамин и эргометрин.

Такой способ получения пептидных алкалоидов маточных рожков введен в фармацевтическую промышленность во многих странах -- России, США, Германии, Канаде, Швеции, Японии и других. Сейчас интенсивно изучаются факторы, которые влияют на биосинтез алкалоидов в сапрофитных культурах рожков [6].

Методы выделения эргоалкалоидов зависят, в первую очередь, от физико-химических свойств индивидуальных соединений, которые отражает классификационная группа эргоалкалоида, а также от решаемых аналитических задач. Для выделения эргоалкалоидов в виде оснований используют, в основном, такие органические растворители как эфир, хлороформ, дихлорметан и др. При получении соответствующих солей применяют подкисленные водные растворы ацетона, спирта метилового, этилового и др. В некоторых случаях, до проведения экстракции, используют различные методы пре- дочистки: сырье обезжиривают с помощью петролейного эфира или других растворителей [8].

Для эргопептидов характерен процесс сольватации, где образование сольвата зависит от используемого растворителя и строения эргоалкалоида. Так, Р-эргокриптин не кристаллизуется из метилового спирта, а эргокорнин образует кристаллосольват с одной молекулой метилового спирта. При кристаллизации из бензола для α- и β-эргокриптинов характерно образование сольватов с двумя молекулами бензола, эрго стин образует сольват с одной молекулой бензола. Эргокриптина мезилат практически не растворим в воде, однако после растворения его в спирте, образующийся сольват смешивается с водой в любых соотношениях. Образование сольватов является необходимым этапом в технологическом процессе выделения эргоалкалоидов [6].

Первые методы выделения эргоалкалоидов были основаны на извлечении эфиром в присутствии аммиака [9]. Более полное и быстрое извлечение эргоалкалоидов достигается при использовании хлороформа и ацетона, однако, при последующей очистке алкалоидов было найдено, что переход цикло-пептидов из хлороформных экстрактов в виннокислые растворы затруднен и может приводить к потерям. Известен метод водной экстракции эргоалкалоидов подкисленными до рН = 2 растворами [8].

Во всех случаях, при работе с эргоалкалоидами необходимо учитывать их высокую лабильность, поэтому большинство работ проводится в затемненных помещениях, при свете красной лампы, тщательно контролируется качество используемых растворителей и реагентов, поддерживается температурный режим, при необходимости ряд работ проводят в среде инертного газа [6].

5. Методы аналитического контроля эргоалкалоидов

В процессе аналитического контроля эргоалкалоидов, в зависимости от решения аналитической задачи, применяют химические, физико-химические, физические методы анализа или их комбинации.

Для идентификации эргоалкалоидов химическими методами используют общеалкалоидные реакции с осадительными реактивами - полийодидами, солями тяжелых металлов, гетерополикислотами и др. [10]. Некоторые из осадительных реактивов обладают селективностью: алкалоиды эрготоксиновой группы осаждаются пикриновой и пикроноловой кислотами и не взаимодействуют с треххлористой сурьмой. Из полийодидов наиболее часто используется реактив Драгендорфа при детектировании эргоалкалоидов на тонкослойных хроматограммах.

В качественном и количественном анализе эргоалкалоидов широко применяются хромогенные реакции с концентрированными кислотами, из которых наиболее распространены специфические реакции на наличие в молекуле алкалоида индольного ядра. Впервые цветная реакция была предложена Тарне в 1875 году - взаимодействие с концентрированной серной кислотой, содержащей следы хлорного железа (окраса от фиолетовой до синей).

Известны цветные реакции с глиоксиловой кислотой в среде концентрированной серной кислоты (сине-фиолетовое окрашивание), ванилином, с реактивом Келлера (пурпурно-синее окрашивание), Ван-Урк (темно-синее окрашивание). Наиболее широко применяют реакции конденсации с и-диметиламинобензальдегидом (и-ДМБ). Эта реакция обладает высокой чувствительностью, и интенсивность образующейся в растворе окраски пропорциональна содержанию эргоалкалоидов, что позволило использовать ее в спектральных методиках количественного определения [11]

Первоначально предложенные методики количественного определения эргоалкалоидов: гравиметрический метод Келлера (осаждение минеральных солей эргоалкалоидов), микрометод Кьельдаля, оксидиметрический метод (окисление эргоалкалоидов бихроматом калия), метод биологической оценки склероций - не нашли широкого применения, и в настоящее время не представляют особого интереса.

Распространенный химический метод количественного определения эргоалкалоидов - титрование в неводных средах - является прямым методом определения по фрагменту молекулы, отвечающему за фармакологическую активность, - третичному атому азота эрголинового ядра. Титрование ведут в среде ледяной уксусной кислоты или ее смесях с уксусным ангидридом, титрант - раствор хлорной кислоты. При визуальном титровании используют индикатор кристаллический-фиолетовый. Метод позволяет вести дифференцированное титрование эргоалкалоидов, при этом отмечено, что основные свойства алкалоидов убывают в ряду: эргометрин - эрготамин - эргокриптин - эргокристин.

Помимо химических методов анализа используются фотоколориметрические методы

Метод фотоколориметрического определения эргоалкалоидов, основанный на применении химической реакции окрашивания с и-ДМБ, был предложен Смитом в 1930 году. Далее метод был усовершенствован: для ускорения реакции добавляли хлорное железо.

Предложен также метод хроматофотоколориметрического определения, основанный на реакции с реактивом Оллпорта. Окрашенный раствор колориметрировали при длине волны 533 нм.

Позднее колориметрическое определение стали проводить с использованием реактива Ван-Урка. В настоящее время эта методика широко используется при проведении массовых анализов по определению суммы алкалоидов в склероциях спорыньи. Колориметрический метод позволяет определить до 90 % активного компонента. При этом побочные продукты окисления эргоалкалоидов не определяются.

Спектрофотометрический метод, применяющийся при количественном определении эргоалкалоидов, обладает высокой чувствительностью (2-10 нг/мл). Однако метод недостаточно селективен. Большинство производных лизергиновой кислоты, включая ряд продуктов деструкции и изомеризации, имеют УФ-спект- ры с максимумом поглощения около 312-313 нм].

В спектрофотометрическом методе анализа используют как прямое определение эргоалкалодов, так и с их продуктами цветных реакций с и-ДМБ (реактивы Ван-Урка, Оллпорта и др.). Образующийся при этом продукт конденсации имеет максимум поглощения в области спектра около 570 нм.

Сочетание методов спектрофотометрии и хроматографии позволяет увеличить селективность определений. Метод хроматоспектрофотометрии используется при изучении селекционных штаммов спорыньи.

Метод флуоресцентной спектроскопии обладает высокой чувствительностью, позволяя определить до 1 нг производных лизергиновой кислоты. Несмотря на идентичность спектров различных эргоалкалоидов, индивидуальное определение возможно при использовании различных длин волн возбуждения. Спектры флуоресценции эргоалкалоидов зависят от применяемого растворителя и рН среды. Спиртовые растворы эргоалкалоидов имеют максимум энергии возбуждения в области 320 - 340 нм, а максимум испускания в области от 400 до 425 нм.

Метод получил широкое применение при изучении продуктов метаболизма эргоалкалоидов и других производных лизергиновой кислоты в организме животных и людей. Обычно флуориметрический метод используют в сочетании с хроматографическими методами анализа.

Метод ИК-спектроскопии эргоалкалоидов в основном используют для идентификации и характеристики индивидуальных природных и синтетических соединений.

Сигналы в ИК-спектре в области 3460, 3160 и 3300 см соответствуют ОН- и NH-группам эргоалкалоидов, сигналы в области 1721 - 1723, 1663, 1644- 1648, 1540-1550 см соответствуют СО-группам, которые являются характеристичными.

Одним из основных методов идентификации эргоалкалоидов, изучения их стереоконфигурации, установления структуры, лабильности, а так же решения других задач, связанных с изменением конфигурации и структуры соединений, является метод ЯМР-спек- троскопии. Метод позволяет также определять соотношение эргоалкалоидов в смеси, с одновременным подтверждением их структуры.

Метод масс-спектрометрии применяется для идентификации и установления строения эргоалкалоидов, характеристики пептидной части молекулы.

Фрагментация эргоалкалоидов по пептидной части молекулы при одинаковых условиях ионизации происходит по общей схеме, в которой значения массы отдельных ионов зависят только от строения пептидного фрагмента молекулы, и являются характеристичными при диагностике соединений. Метод масс-спектрометрии позволяет достаточно быстро определить возможные изменения, произошедшие в пептидной части эршалкалоида. Метод был применен при изучении ротамеров эргометрина и эргина.

Метод бумажной хроматографии (БХ) впервые применил Фостер для разделения эргометрина и его изомеров. Штолль исследовал применение метода БХ для разделения эргоалкалоидов различных групп, используя подвижные фазы на основе формамида и воды с различными значениями рН среды. Метод БХ успешно применялся для разделения пептидных эргоалкалоидов, алкалоидов эрготоксиновой группы и в анализе эрготамина тартрата, для чего используются различные подвижные фазы: смеси бензола с формамидом, хлороформ с метиловым спиртом, ацетон или эфир с добавлением концентрированного раствора аммиака.

Метод хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в настоящее время практически полностью вытеснил применение БХ. Метод ТСХ используют для разделения и идентификации эргоалкалоидов, исследования алкалоидного состава в скле роциях спорыньи, изучения стабильности при хранении лекарственных препаратов, путей деструкции, определения содержания примесей в лекарственном веществе и т.д. Наряду с инструментальными методами анализа, ТСХ используют для установления аминокислотного состава пептидной части молекулы.