Витамины, получаемые с помощью микробного синтеза. Витамин В12, химическое строение продуцентов

      Цианкобаламин - единственный водорастворимый витамин, который содержит незаменимые минеральные элементы.

      Функции: формирует и восстанавливает эритроциты, предотвращая анемию, у детей способствует росту и улучшению аппетита, поддерживает нервную систему в здоровом состоянии, снижает раздражительность, улучшает память, концентрацию.

Содержание витамина В12 в  продуктах:

                             Продуценты витамина В12.

      В природе витамин B₁₂ и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина B₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Propionibacterium [1, 4, 5].Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0-8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант Р. shermaniiМ-82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина [1,5]. В семействе Propioni bacberiaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витамина B₁₂в клетках. Это, прежде всего Eubacterium limosum Butyribacterium rettgerii).Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов [1, 4]. Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardiarugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина B₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusса, M. chalceae. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например Methanosarcina barkeri, M. vacuolataи отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus [1, 4].Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridlum tetanomorphum и Cl. sticklandil аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин B₁₂ ацетогенные клостридий Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂. Известны активные продуценты витамина B₁₂ у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 – мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Интерес представляют термофильные бациллы, а именно Bacillus circulans и Вас. stearothermophilus, которые растут соответственно при 60 и 75 °С и за 18 ч. культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие (2,0-6,0 мг/л) выходы витамина. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas palustris, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobactersphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirillumrubrum, Chromatiumuinosumи ряд других видов. Значительные количества витамина B₁₂ образует цианобактерии Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus.

      Продуценты витамина B₁₂ культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья. Achromobactersp., используя изопропиловый спирт как источник углерода и энергии, накапливает до 1,1 мг/л провитамина, Pseudomonassp. синтезирует витамин B₁₂ в среде с метанолом или пропандиолом (до 160 мкг/л), факультативный метилотроф образует в среде с метанолом до 2,6 мг/л витамина. Выделен штамм Klebsiella 101, образующий большое количество корриноидов в клетках только при росте на среде с метанолом как единственном источнике углерода и энергии.

Биосинтез витамина В₁₂:

                               Причины авитаминоза.

      Авитамино́з — заболевание, являющееся следствием длительного неполноценного питания, в котором отсутствуют какие-либо витамины.

      Впервые эту разновидность дефицитных анемий описал Аддисон в 1849 г., а затем в 1872 г. - Бирмер, назвавший ее "прогрессирующей пернициозной" (гибельной, злокачественной) анемией. Причины, вызывающие развитие анемий указанного вида, могут быть разделены на две группы:

• недостаточное поступление витамина В12 в организм с продуктами питания
• нарушение усвоения витамина В12 в организме

      Анемии, возникающие по этой причине, протекают тяжело, трудно поддаются лечению, именно в связи с этим указанные формы мегалобластических дефицитных анемий называют пернициозными или анемиями Аддисона - Бирмера. Витамин В12 (цианокобаламин) содержится в животных продуктах - мясе, яйцах, сыре, печени, молоке, почках. В этих тканях он связан с белком. При кулинарной обработке, а также в желудке цианокобаламин освобождается от белка (в последнем случае - под влиянием протеолитических ферментов). В свободном состоянии витамин В12 образует комплекс с синтезирующимся в желудке гликопротеином и в таком виде всасывается в кровь. Недостаток витамина В12 в указанных продуктах, голодание или отказ от употребления пищи животного происхождения (вегетарианство) нередко обусловливают развитие витамин В12 - дефицитной анемии. Витамин В12, поступающий в организм с пищей, по предложению Кастла (1930) называют "внешним фактором" развития анемии. Париетальные клетки желудка синтезируют термолабильный щелочеустойчивый фактор (его обозначают как "внутренний фактор" Кастла), представляющий собой гликопротеин с молекулярной массой 50 000 - 60 000. Комплекс витамина и гликопротеина связывается со специфическими рецепторами клеток слизистой оболочки средней и нижней части подвздошной кишки и далее поступает в кровь. Незначительное количество витамина В12 (около 1 %) всасывается в желудке без участия внутреннего фактора. Запасы витамина В12 в организме достаточно велики (около 2 - 5 мг). В основном он депонируется в печени. Из организма ежедневно выводится с экскрементами около 2 - 5 мкг. В связи с этим дефицит витамина при значительном снижении его поступления и (или) усвоения развивается лишь через 3 - 6 лет. Недостаток витамина В12 в результате нарушения и (или) снижения его всасывания может быть следствием уменьшения или прекращения синтеза внутреннего фактора Кастла; нарушения всасывания комплекса "витамин В12 + гликопротеин" в подвздошной кишке; повышенного расходования витамина; "конкурентного" использования витамина В12 в кишечнике паразитами или микроорганизмами.

      Недостаточность цианокобаламина, известная под названием болезни Адиссона-Бирмера, проявляется развитием пернициозной анемии и связана главным образом с нарушением всасывания цианокобаламина в результате снижения или полного прекращения секреции гастромукопротеина. Пернициозная анемия может быть вызвана и другими причинами (полипоз, рак желудка, коррозивный гастрит, состояние после резекции желудка); патологией тонкой кишки (энтерит типа спру, состояние после резекции), а также дифиллоботриозом. К развитию пернициозной анемии может вести и нарушение утилизации цианокобаламина костным мозгом (ахрестическая анемия).

      Витамин В12 активно действует в сообществе с витамином В9 (фолиевая кислота).

При недостатке витамина В12 возникают:

• нарушение кроветворения,
• анемии,
• поражение нервной системы (парестезии, параличи), вплоть до необратимых нарушений,
• синдром хронической усталости,
• нарушения со стороны органов пищеварения: тошнота, потеря аппетита, изъязвления языка, ахилия, атония кишечника,
• функциональные расстройства центральной нервной системы: раздражительность, утомляемость, депрессия, нарушения сна.

Причины недостатка витамина В12

      Для всасывания витамина В12 необходим внутренний фактор Кастла, который вырабатывается в слизистой оболочке желудка. При нарушении его выработки нарушается всасывание витамина В12. Витамин В12 синтезируется микрофлорой кишечника, откуда поступает в органы, накапливаясь в наибольших количествах в печени, почках, стенке кишечника. Но синтезом в кишечнике потребность организма в витамине В12 полностью не обеспечивается.

      Существуют экзогенные и эндогенные причины дефицита витамина В12.

      Экзогенная (алиментарная) недостаточность связана с длительным неупотреблением животных продуктов, которые являются единственным источником витамина В12.

      Эндогенная недостаточность связана с отсутствием или пониженной выработкой внутреннего фактора Кастла, что наблюдается при атрофии слизистой оболочки желудка или его удалении. Имеют значение: наследственность (нет ферментов, которые участвуют в транспорте витамина В12), хронические заболевания желудочно-кишечного тракта (хронический ахилический и хронический анацидный гастрит, синдром раздраженного кишечника, дисбактериоз, глистная инвазия).

      Для профилактики эндогенной недостаточности витамина В12 необходимо целенаправленно лечить хронические заболевания желудочно-кишечного тракта. Надо помнить, что лечение заболеваний желудка, и особенно кишечника, требует определенных усилий и комплексного подхода. Потребуется наблюдение у врача-гастроэнтеролога, длительное соблюдение диеты, приём пищеварительных ферментов, биопрепаратов, витаминов, настоев лекарственных растений, минеральных вод.

                         Производство витамина В12.

      В нашей стране в качестве продуцента витамина В₁₂ используют Propionibacteriumf reudenreichii var. Shermanii [1,5].Для получения витамина B₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник – 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин B₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5-5,0 при 85-90 С в течение 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25%-ной NaNO₂. При получении Ko-B₁₂ стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина B₁₂ охлаждают, доводят рН до 6,8-7,0 50%-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Аl₂(SO4)₃*18H₂Oи безводный FеСl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Al₂O₃. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом Ko-B₁₂ может быть отделен от CN- и оксикобала мина. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3-4°С 24-48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Для предотвращения разложения Ko-B₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом, можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом. Для химической очистки витамина B₁₂ используется его способность образовывать продукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделение витамина B₁₂от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина B₁₂ с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат.

      Среди неполимерных соединений витамин B₁₂ имеет самое сложное строение. Это α (5,6-диметилбензимидазол) – кобамидцианид:

      В молекуле витамина B₁₂ различают:

   1. Порфириноподобное, хромофорное, или корриновое, кольцо, связанное с атомом кобальта четырьмя координационными связями через атомы азота.

   2. Верхним координационным лигандом кобальта в витамине B₁₂ является цианогруппа. Ее место могут занимать другие неорганические или органические заместители, например NO₂^2-, SO₂^2-, ОН^-, H₂O, CH₃, аденозил; заместители определяют название производных витамина B₁₂.

   3. Шестая позиция кобальта занята нуклеотидным ядром (нижним лигандом кобальта), состоящим из азотистого основания, рибозы и остатка фосфорной кислоты. Нуклеотидное ядро связано с кобальтом через азот основания, а с корриновым кольцом через аминопропаноловый мостик.

      В составе витамина B₁₂ или цианкобаламина азотистое основание представлено 5,6-диметилбензимидазолом (5,6-ДМБ). Наличие 5,6-ДМБ определяет активность молекулы корриноидов (синоним названия витаминов группы B₁₂) для высших животных. Вместо 5,6-ДМБ микроорганизмы могут включать в молекулу другие бензимидазольные и пуриновые основания. Нуклеотидное ядро вообще может отсутствовать, как в случае фактора В.

      Через 25 лет после открытия витамина B₁₂ в 1972 г. в результате многолетних исследований был осуществлен полный химический синтез корриноидной структуры. Корриноид синтезирован в результате тридцати семи последовательных ступеней, но в силу сложности такого синтеза микробиологический метод остается пока единственным промышленным способом получения витамина B_12.

                  Применение витамина В12.

      Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B₁₂ используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, таки в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Для нужд животноводства витамин B₁₂ получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии. Установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метан образующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum, Mb. thermoautotrophicum при росте в присутствии H₂ и CO₂. Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0-6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина B₁₂-KMБ12. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0-2,5 %сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м³ СоСl₂ и 0,5% метанола как стимуляторы синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN=B₁₂и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80% от суммы всех корриноидов. Исходная барда имеет температуру около 100°С и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55-57°С. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное «метановое брожение» сточных вод. Получение концентрата витамина B₁₂включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года. Важное условие нормального процесса брожения – контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин B₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют – Cl до оптимального значения рН 5,0-5,3 и сульфит Na(оптимальное содержание 0,07-0,1%). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90–95°С при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.