Отчет по преддипломной производственной практике

 

 

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра биохимии

 

 

 

 

 

 

 

 

  Отчет

по преддипломной производственной практике

 

 

 

 

 

 

Студентки 5 курса 8 группы

Силиверстовой А.И.

Научный руководитель:

канд. биол. наук,

доцент Филимонов М.М.

Руководитель практики:

Кузнецова Е.И.

 

 

 

 

 

 

Минск 2013

 

Цели и задачи практики

Учебная биотехнологическая практика проходила на базе кафедры биохимии БГУ в период с 11марта по 20 апреля 2013 г.

Цель практики: изучение влияния аллоксана, лактоферрина и яичного альбумина на активность Na+,K+-АТФазы .

Задачи практики:

• показать влияние перорального введения лактоферрина и яичного альбумина на активность Na+,K+-АТФазы в гомогенате мозга крыс с аллоксановым диабетом,
• провести  обработку результатов  и провести обсуждение с привлечением литературных данных.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Материалы и методы.

 

1. Постановка эксперимента.

В эксперименте  использовались лабораторные белые крысы массой 150-200 грамм. Были взяты шесть серий по пять животных в каждой. Животные первой серии были интактными. Животным второй  серии вводили аллоксан внутрибрюшинно, доза которого составляла 50 мг/кг. Животных серии 2 выдерживали 1 неделю после инъекции. Животным третьей серии вводили по 200 мкл лактоферрина перорально на протяжении 5 дней, а затем проводили измерения активности фермента. Животные четвертой серии  были выдержанные 1 неделю после введения внутрибрюшинно аллоксана 25 мг/кг и на протяжении 5 дней вводили перорально по 200 мкл лактоферрина. Животным пятой серии вводили по 200 мкл яичного альбумина перорально на протяжении 5 дней, а затем проводили измерения активности фермента.  Животные шестой серии были выдержанные 1 неделю после введения внутрибрюшинно аллоксана 25 мг/кг и на протяжении 5 дней вводили перорально по 200 мкл яичного альбумина.

 

2.Определение активности Na+,K+-АТФазы.

 

2.1.Приготовление гомогената головного мозга

Для определения активности Na+,K+-АТФазы использовался гомогенат головного мозга крыс.

После декапитации голову крысы помещают на лед, вскрывают черепную коробку по боковой стороне черепа, введя ножницы через канал продолговатого мозга. Пинцетом снимают крышу черепа, извлекают мозг и помещают его в стакан с охлажденной средой выделения. Все инструменты для выделения мозга также должны быть охлаждены.

Состав среды выделения:

сахароза - 0,32 М

ЭДТА - 0,001 М

Трис-HCl буфер - 0,01 М, рН 7,5

Среда выделения готовится в день опыта.

Мозг промывают в среде выделения, просушивают фильтровальной бумагой, удаляют кровеносные сосуды и оболочки мозга. Отделяют большие полушария, измельчают их ножницами на часовом стекле или целлофане до состояния кашицы. 1 грамм ткани гомогенизируют с 9 мл среды выделения в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.

Условия гомогенизации:

1 г ткани + 2 мл СВ – 30 секунд,

                 + 3 мл СВ – 30 секунд,

                 + 3 мл СВ – 30 секунд.

При этом соблюдают частоту движений пестика (15 движений на этап) и длительность временного промежутка между этапами (около 20 секунд).

Стакан гомогенизатора находится в стакане со льдом.

После гомогенизации содержимое стакана гомогенизатора фильтруют через тройной слой марли в мерный цилиндр, ополаскивают стакан гомогенизатора 7 мл СВ и также сливают на фильтр, а затем доводят объем гомогената в цилиндре до 10 мл.

Полученный 10% гомогенат можно хранить замороженным в эппендорфах в течение месяца без потери активности фермента.

 

2.2. Измерение содержания неорганического фосфата в среде инкубации по методу Ратбуна и Бетлах [4]

Активность Na+,K+-АТФазы измеряют по разнице в накоплении неорганического фосфата (Рн) в средах инкубации, используемых отдельно для определения активности общей  АТФазы и Mg-АТФазы:

 

[Pн] Na+,K+-АТФазы = [Pн]общей АТФазы–[Pн] Mg-АТФазы

 

Среда инкубации для определения активности Mg-АТФазы отличается от среды инкубации для общей АТФазы отсутствием ионов Na+, при этом для поддержания ионной силы раствора в пробе для Mg-АТФазы эквимолярно увеличивают концентрацию  ионов K+.

Для определения активности Na+,K+-АТФазы использовался гомогенат мозга белых крыс, из которого путем разбавления получали ферментный препарат. Перед определением активности гомогенат выдерживают при комнатной температуре для оттаивания. После размораживания из гомогената получают ферментный препарат путем разбавления гомогената дистиллированной водой в отношении 1:9. При этом достигается такое разбавление гомогената, при котором отношение активности общей АТФазы к активности Mg-АТФазы равно или превышает значение 1,3, что является удовлетворительным для успешного определения активности Na+,K+-АТФазы. Среда инкубации для определения активностей общей и Mg-АТФаз содержат следующие компоненты (таблица 1).

1. Таблица 1. Схема создания среды инкубации ( W.B.Rathbun,  M.V.Betlach.  Estimation of enzymatically produced orthophosphate in the presence of cystein and adenosine triphosphate, 1969)

 

Реактивы	Начальная концентрация, мМ	Концентрация в пробе, мМ	Проба для общей АТФазы, мл	Проба для Mg-АТФазы, мл	Контроль на АТФ, мл	Контроль на Pн, мл
Трис-HCl, pH=7,4	60	30	0,5	0,5	0,5	0,5
MgCl2	30	3	0,1	0,1	0,1	0,1
NaCl/KCl	1300/200	130/20	0,1	-	0,1	0,1
KCl	1500	150	-	0,1	-	-
H2O	-	-	0,1	0,1	0,2	0,1
Ферментный препарат	-	-	0,1	0,1	-	0,1*
АТФ	30	3	0,1	0,1	0,1*	0,1*
Конечный объем пробы, мл	-	-	1	1	1	1

* - отмечены объемы ферментного  препарата и АТФ, которые вносят в пробы после окончания инкубации и внесения ТХУ.

С момента внесения ферментного препарата пробы помещают в термостат, где выдерживают 10 минут  при 37◦С (преинкубация). Затем запускают реакцию путем внесения АТФ (тщательно перемешивая при этом пробы) и выдерживают еще 20 минут при 37◦С (инкубация). По истечению времени инкубации реакцию останавливают внесением 0,6 мл 13,35% охлажденной ТХУ, встряхивают и оставляют на льду до момента определения содержания неорганического фосфата.

Содержание неорганического фосфата в пробах определяют по методу Ратбуна и Бетлах [3].

В основе метода лежит образование комплекса между неорганическим фосфатом и молибдат-аниономМоО42-, имеющего синюю окраску.

Таблица 2.Схема определения Рн ( W.B.Rathbun,  M.V.Betlach.  Estimation of enzymatically produced orthophosphate in the presence of cystein and adenosine triphosphate, 1969)

 

Реактивы	Начальная концентра-ция	Конечная концентра-ция	Проба для общей или Мg-АТФазы, мл	Контроль на АТФ, мл	Контроль на Рн, мл
ТХУ	13,35%	5%	0,6	0,6	0,6
Ацетатный буфер + формалин (рН 4,3)	3М	-	1,1	1,1	1,1
(NH4)2MoO4	2%	-	0,1	0,1	0,1
SnCl2	6,75мМ	-	0,2	0,2	0,2

 

Для осуществления этой реакции комплексообразования в среду сначала вносят ТХУ для остановки реакции путем осаждения белка. Также необходимо внести хлорид олова, выступающий в качестве восстановителя, а также смесь ацетатного буфера и формалина (рН=4,3) для обеспечения эффективного образования комплекса и стабильности оставшейся в пробе АТФ.Компоненты проб для определения Рн вносят по следующей схеме (таблица 2). Пробы тщательно перемешивают, и после развития синего окрашивание фотометрируют при 660 нм.

Концентрацию неорганического фосфата  в пробах определяют по калибровочному графику, который строят на основе данных, полученный при фотометрировании проб с известной концентрацией Рн, внесенного в них в виде дигидрофосфата калияKH2PO4.

Для построения калибровочного графика в пробы были внесена следующая концентрация Рн (таблица 3). Пробы фотометрировались на фотоколориметре КФК-2 при 650 нм. Калибровочная кривая по Рн представлена на рисунке 5.

Таблица 3. Построение калибровочного графика по Рн ( W.B.Rathbun,  M.V.Betlach.  Estimation of enzymatically produced orthophosphate in the presence of cystein and adenosine triphosphate, 1969)

 

№ пробы	Концентрация Рн в пробе, нмоль/мл	D1	D2	D3	D среднее
1	10	0,072	0,076	0,068	0,072
2	20	0,17	0,121	0,15	0,147
3	30	0,225	0,23	0,181	0,212
4	40	0,28	0,29	0,282	0,284
5	50	0,34	0,355	0,346	0,347
6	70	0,49	0,50	0,48	0,490
7	90	0,60	0,635	0,625	0,620

 

λ=650 нм, l=0,5 см

Рис. 5

 Калибровочная кривая  по неорганическому фосфату (метод  Ратбуна и Бетлах)

 

2.3. Определение содержания белка в гомогенате мозга с помощью фенольного реактива Фолина-Чокальтеу (метод Лоури) [2]

В основе метода лежит явление образования синего окрашивания при взаимодействии фенольного реактива с белками в щелочной среде за счет наличия в них тирозина и триптофана. Метод сочетает в себе реакцию Фолина с биуретовой реакцией.

Белок  осаждают 13% ТХУ (2 мл на 1 млисследуемого раствора), отстаивают 20 минут и затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин.

Затем сливают надосадочную жидкость, а белок растворяют в 0,1 мл 0,1н NaOH и доводят до 25 или 50 мл водой.

В пробу вносят 0,4 мл исследуемого раствора и 2 мл рабочего реактива, отстаивают 10 минут и добавляют 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу (1н).

Рабочий реактив: 50 мл раствора 1 + 1 мл раствора 2.

Раствор 1: 2% раствор Na2CO3в 0,1 н растворе NaOH.

Раствор 2: 0,5% раствор CuSO4*5H2O в 1% растворе цитрата натрия.

Отстаивают пробу 30 минут в темноте, при этом развивается синее окрашивание. Пробы фотометрируют при λ=750 нм.

Концентрацию белка в пробе определяют по калибровочной кривой, построенной по данным фотометрирования проб, содержащих известное количество бычьего сывороточного альбумина. Для построения калибровочной кривой были взяты следующие концентрации белка (таблица 4). Пробы фотометрировались на КФК-2. Калибровочная кривая представлена на рис. 6.

Таблица 4. Построение калибровочного графика по белку методом Лоури ( O.H.Lowry,  N.J. Rosebrouch,  A.L.Farr. Protein measurement with the Folin phenol reagent ,1951)

№ пробы	Концентрация белка в пробе, мкг/мл	D1	D2	D3	D среднее
1	10	0,026	0,032	0,026	0,028
2	20	0,06	0,052	0,056	0,056
3	40	0,11	0,10	0,105	0,105
4	60	0,14	0,17	0,17	0,160
5	80	0,215	0,217	0,21	0,214
6	100	0,27	0,27	0,24	0,26