Особенности генома прокариот

    Бактериальная хромосома содержит до 5*10⁶ пар оснований. Для сравнения: геном человека составляет 2,9*10⁹пар оснований. В бактериальных клетках хромосома сильно компактизована. Так, кольцевая молекула ДНК Е. coli длиной -1,5 мм заключена в клетку, имеющую форму палочки диаметром 1 мкм и длиной 2 мкм [6].

    Полная  нуклеотидная последовательность бактериальной  хромосомы позволяет определить структуры генома, связанные с его функционированием, то есть с процессами репликации, транскрипции, трансляции, регуляции и так далее. 

    3.2 Структура прокариотических генов 

    Ген — единица наследственной информации, занимающая определенное положение  в геноме или хромосоме и контролирующая выполнение определенной функции в  организме [7].

    По  результатам исследования прокариот, главным образом Е. coli, ген состоит из двух основных элементов: регуляторной части и собственно кодирующей части. Регуляторная часть гена обеспечивает первые этапы реализации генетической информации, заключенной в структурной части гена. Структурная часть гена содержит информацию о структуре кодируемого данным геном полипептида. Количество некодирующих последовательностей в структурной части гена у прокариот минимально. 5'-конец прокариотического гена имеет характерную организацию регуляторных элементов, особенно на расстоянии 50 — 70 н.п. от точки инициации транскрипции. Этот участок гена называют промотором. Он важен для транскрипции гена, но сам в РНК не транскрибируется. Противоположный З'-конец — терминаторная область, необходимая для терминации транскрипции. В РНК он также не транскрибируется. Транскрипция начинается со стартовой точки (+1).

    Промотор  имеет две консервативные последовательности: одна состоит из 6 или 7 пар оснований  и расположена на расстоянии ~ 10 оснований  от стартовой точки; ее обозначают как -10-последовательность, или бокс Прибнова, — в честь ее первооткрывателя. Вторая последовательность, длина которой равна обычно 9 нуклеотидам, расположена на расстоянии -35 оснований от сайта инициации (рисунок 2). Эта 35-последовательность участвует в связывании РНК-полимеразы; в боксе Прибнова РНК-полимераза начинает локальное раскручивание спирали и создает условия для инициации синтеза РНК.

    Последовательности  ДНК, являющиеся сигналами остановки  транскрипции, находятся на З'-конце  гена и называются транскрипционными терминаторами [8].

    Они содержат последовательности, которые в транскрибируемой РНК формируют структуру шпильки. Последовательность оснований в этом месте способствует образованию стабильных пар G —С за счет водородных связей. Вслед за шпилечной структурой в транскрипте РНК находится несколько остатков U, дающих слабое связывание РНК с ДНК. Это и облегчает терминацию транскрипции [5]. 

    Рисунок 2. Структура промотора и терминатора прокариотических генов:

    А — консенсусные последовательности элементов промотора Е. coli; Б — структуры терминаторных шпилек в РНК прокариот 
 

    Участок ДНК между промотором и терминатором называется единицей транскрипции. Последовательности, кодирующие белки, бывают обычно фланкированы нетранслируемыми сегментами (их обозначают 5'-НТП и З'-НТП). Гены РНК перемежаются спейсерными (от английского «spacer» — «распорка») последовательностями, которые вырезаются в ходе процессинга рРНК и тРНК (рисунок 3).  

    Рисунок 3. Строение прокариотических генов: А — ген, кодирующий один белок; Б — гены, кодирующие рРНК и тРНК 

    У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто бывают сцеплены [9].

    Они транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным (или полигенным) транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном. Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы у Е. coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности [10].

    При сравнении геномов Е. coli и В. subtilus, имеющих около 1000 общих генов, отмечено, что 100 из них находятся в составе одних и тех же оперонов, хотя в некоторых случаях порядок генов в оперонах изменен (арабинозный оперон ага ABD у В. subtilis и ага BAD у Е. coli) (рисунок 4). 

    Рисунок 4. Оперонная организация генов прокариот:

    А — общая схема оперона; Б — галактозный оперон Е. coli. Представлены оператор (О), промотор (Р) и три гена оперона — gal E, gal T, gal К. Внизу показаны реакции, катализируемые тремя генными продуктами — галактокиназой, уридилтрансферазой и UDP-галактозоэпимеразой. Все три фермента транслируются единственной полицистронной gal мРНК, ген gal R, кодирующий репрессор галактозного оперона, не сцеплен с опероном 

    Гены, кодирующие несколько родственных  функций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие рибосомные белки, организованы во множественные опероны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, участвующие в транскрипции и/или трансляции. Как правило, отдельные опероны, кодирующие родственные функции, имеют одинаковые или сходные регуляторные последовательности и поэтому реагируют на определенный регуляторный сигнал сходным образом.  
 

    3.3 Бактериальные плазмиды 

    Мобильные элементы генома - последовательности ДНК, способные перемещаться внутри генома живых организмов. Существует несколько классов мобильных элементов генома, отличающихся по строению и способу перемещения:

1. Инсерционные элементы, например, IS-элементы
2. Транспозоны, например, Tn
3. Профаги - латентная форма умеренных бактериофагов, например, транспозонподобного фага Mu (мю)
4. Плазмиды - эписомы, например, половой фактор кишечной палочки (F-плазмида)

    Кроме хромосомы у большинства бактерий существуют другие способные к автономной репликации структуры — плазмиды. Это двуцепочечные кольцевые ДНК размером от 0,1 до 5% размера хромосомы, несущие гены, необязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или R-факторов (от англ. resistance — устойчивость). Другие плазмиды определяют болезнетворность патогенных бактерий, например патогенных штаммов Е. coli, возбудителей чумы и столбняка. Третьи — определяют способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, например углеводороды нефти [5].

    Существуют  разные виды классификации плазмид, но чаще всего основу классификации  составляет наличие в плазмидах  определенных модульных сегментов ДНК. Для своей репликации плазмиды используют репликативный аппарат клетки-хозяина, однако репликация плазмид происходит независимо от хромосомы. Каждая плазмида является самостоятельным репликоном, сама контролирует собственную репликацию. Для этой цели она должна иметь по крайней мере один или несколько репликативных модулей (область инициации репликации), которые и позволяют ей автономно реплицироваться. В одном из классов плазмид (F-плазмид, от английского «fertility» - «плодовитость») репликация и сегрегация регулируются согласованно с репликацией бактериального генома, и в каждой клетке содержится одна или две копии плазмиды. О таком типе репликации говорят как о репликации со строгим контролем. Второй тип репликационного модуля свободен от такого контроля, что приводит к существованию в клетке многих копий плазмид (10—30 копий). Подобный тип репликации получил название репликации с ослабленным контролем [11].

    Наличие других модулей, не связанных с репликацией, не является обязательным для каждой определенной плазмиды. Половые факторы, то есть конъюгативные (или самотрансмиссивные) плазмиды, подобно F-фактору имеют модули, содержащие гены и регуляторные области (гены tra), необходимые для переноса плазмиды из одной клетки в другую. Трансмиссивные плазмиды кодируют специальные ворсинки, половые пили, которые появляются на поверхности клеток, содержащих плазмиды, и способны специфически связываться с поверхностью бесплазмидных клеток. Последующее сокращение пиля притягивает клетки друг к другу, и между ними образуется мостик, через который плазмидная ДНК может передаваться в новую клетку. Способность передаваться в новые клетки — полезное для плазмид качество, но лишь большие плазмиды могут кодировать сложную систему поверхностных изменений клетки, обеспечивающую конъюгацию [9].

    Неконъюгативные плазмиды (утратившие модуль конъюгации) не способны к самотрансмиссивности, но способны к передаче в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации. Такие плазмиды называют мобилизуемыми.

    Модули  другого типа содержат гены, белковые продукты которых (например, Р-лактамаза и другие) инактивируют антибиотики. Плазмиды, несущие такие модули, часто называют R-плазмидами (рисунок 5). Одна плазмида обеспечивает устойчивость к нескольким антибиотикам, при этом все или несколько генов резистентности разного типа могут быть сгруппированы в одном модуле [12]. 

    Рисунок 5. Структура типичной конъюгативной R-плазмиды.

    Светлый овал — область начала репликации (ori). Гены резистентности к антибиотикам: тетрациклину — tef, хлорамфениколу — саm^r, канамицину — kan^r, стрептомицину — stf

    Имеется еще один тип модулей, встречающийся  в плазмидах: Col-модули. Они кодируют один из нескольких белков-колицинов (антибактериальных агентов, продуцируемых бактериями). Колицины различаются по структуре и способу действия. Плазмиды, кодирующие определенный колицин, часто содержат гены, обеспечивающие иммунность к этому колицину, страхуя клетку-продуцент от повреждений, вызываемых ее собственным средством защиты [13].

    Около 50 % последовательностей из приблизительно 100 тыс. н.п. этих плазмид гомологичны одному из участков F-плазмиды. Эта область включает гены, необходимые для конъюгации (tra) и репликации со строгим контролем. В F-подобной области находится дополнительный модуль, содержащий гены, контролирующие устойчивость к тетрациклину. Вторая половина R-плазмиды не родственна F и содержит модули, ответственные за резистентность к антибиотикам (стрептомицину, сульфаниламидам, хлорамфениколу и канамицину) [10].

    Плазмиды, выделенные независимо и даже в различных  частях света, часто содержат близкородственные модули (одни и те же гены резистентности к антибиотикам). На основании этих данных возникло представление о том, что между геномами происходит обмен некоторыми генетическими модулями в виде интактных сегментов ДНК. Быстрое распространение генов резистентности к антибиотикам объясняется именно обменом модулями между плазмидами. Эти и другие данные, полученные при изучении генетики бактерий, привели к идентификации подвижных элементов, названных инерционными последовательностями (IS) и транспозонами, которые способны перемещаться не только между плазмидами, но и между плазмидными и клеточными геномами, а также в пределах самого бактериального генома [8].

    Способность плазмид быстро копироваться и передаваться из клетки в клетку при внутривидовой, межвидовой и межродовой конъюгации бактерий определяет важную роль плазмид в эволюции этих организмов. Плазмиды как автономные единицы репликации (репликоны) широко применяются в экспериментах по генетической инженерии. Их используют для получения в промышленных масштабах биологически активных белков — ферментов, гормона роста, инсулина и других. Способность многих плазмид выполнять роль половых факторов бактерий дает возможность применять их для экспериментального получения различных гибридных форм и генетического картирования этих организмов. Обнаружение в популяциях различных видов патогенных и условно-патогенных бактерий плазмид, контролирующих их вирулентные свойства, позволяет предположить, что плазмиды имеют определенное значение в инфекционной патологии и развитии эпидемических процессов. Данные о типах R-плазмид и их распространенности в современных сообществах микроорганизмов необходимы для разработки рациональной стратегии использования антибиотиков и других антибактериальных средств при лечении инфекционных болезней. Межвидовой и межродовой перенос плазмид, контролирующих различные метаболические функции клетки (например, способность сбраживать строго определенные углеводы, образовывать сероводород и др.), служит одной из причин образования атипических форм бактерий, что затрудняет диагностику инфекционных болезней [11].