Оценка генотоксичности нового радиопротектора микроядерным тестом в клеточной линии KCL22

предотвращал   гибель   большого   числа   животных.   К настоящему времени проверены радиозащитные  свойства  тысяч  химических соединений. К   наиболее эффективным  средствам  относятся  цистеамин,  цистамин,   аминоэтил-изотиуроний (АЭТ), гаммафос (WR-2721), серотонин и мексамин.  В России цистамин разрешен для клинического применения при радиотерапии с целью уменьшения нежелательных пострадиационных эффектов.

Протекторы  кратковременного  защитного  действия (продолжительность защитного действия в  пределах  нескольких  минут  или  часов) чаще  всего относятся  к веществам химической природы. Длительное защитное действие возникает  после  введения веществ  в  основном  биологического  происхождения. В  последнее  время  повысился интерес  к  вопросам  профилактики  лучевой  болезни  с помощью  витаминов, ферментов и гормонов. Для  большинства  витаминов  и  гормонов, используемых  для  профилактики, характерно  благоприятное  действие  только при облучении  в сублетальных дозах  и  многократном  введении,  нередко  за  большой  период  времени  до облучения.

Использование химических радиопротекторов при  радиотерапии  не  получило широкого распространения, поскольку, по мнению радиологов, нельзя  различить защиту здоровых и опухолевых тканей. Защита опухолевых  клеток  от  действия ионизирующего излучения, безусловно, нежелательна. Цистеамин  или  АЭТ  явно обеспечивают защиту экспериментальных опухолей.

Многие  радиозащитные  вещества  высокотоксичны  и могут  вызвать  негативные  побочные  реакции. Подавляющее  большинство  химических  защитных средств  действует  только  при  условии,  если  их вводят  до  начала  облучения  или  в  процессе  его,  и  не  оказывают положительного  эффекта,  будучи  введенными  после  воздействия  ионизирующей радиации. Механизм  защитного  действия радиопротекторов  теснейшим  образом  связан  с физико-химическими  процессами в клетке. В  то  же  время, они активно вмешиваются  в метаболические  реакции.  Многие  гипотезы механизмов защитного действия  протекторов  сводятся к тому, что  в  момент  облучения необходимо  ингибировать  биосинтез  клеток.

 

 

5. Применение МЯ теста для оценки радиопротекторных соединений

 

Ионизирующая  радиация генерирует свободные радикалы при прохождении через живые  ткани. Взаимодействие свободных радикалов  с ДНК вызывает генетические повреждения, ведущие к мутагенезу и канцерогенезу (Reily, 1994). Так как ионизирующая радиация применяется в медицинской практике разработка активных радиомодификаторов является актуальной задачей.

Во многих исследованиях соединений с радиопртекторными  свойствами применяется МЯ тест.Показано, что флавоноид гесперидин является активным радиопротектором по отношению  к действию гамма-радиации. Гесперидин снижает индуцированный гамма-облучением уровень МЯ у мышей (Hosseinimehr and Neamti,  2006).

МЯ тест применялся для оценки радиопротекторных свойств  препарата Дафлон (очищенная фракция  флавоноидов, включающая 90% диосмина и 10% других ингредиентов) в культивируемых лимфоцитах человека. Образцы крови  брались у добровольцев за 10 минут до приема Дафлона и через 1, 2 и 3 часа после приема. Клетки крови облучались гамма-лучами. Наиболее активный протекторный эффект был зарегистрирован при взятии крови через 1 час после приема препарата, при этом частота МЯ была снижена на 40% (Hosseinimehr et al., 2009 50 (9) p. 749).

Амифостин и  мелатонин в облученных гамма-лучами лимфоцитах человека снижают уровень МЯ, индуцированный гамма-лучами. Радиопротекторные свойства сочетаются с практически полным отсутствием побочных эффектов (Kopjar et al., 2006).

Флавоноиды – вещества с высокой антиоксидантной активностью присуствующие в больших количествах в пище. Один из флавоноидов апигенин  снижает уровень МЯ в лимфоцитах человека облученных гамма-радиацией (Rithidech et al., 2005).

Экстракт сухих корней китайского женьшеня обладает радиопротекторным эффектом в лимфоцитах периферической крови человека, снижая уровень МЯ индуцированный облучением (137)Cs. Китайский женьшень можно рекомендовать в качестве радиопротектора для нормальных тканей при радиотерапии  (Lee et al., 2004).

Предобработка облученных гамма-радиацией лимфоцитов человека каротиноидом ликопеном оказывает  радиопротекторное действие (Srinivasan et al., 2009). 

Помимо радиопротекторных  соединений с применением МЯ теста  изучаются также соединения, защищающие от химических мутагенов. Антимутагенная активность водных экстрактов зеленого китайского чая, полифенолов и катехинов  чая по отношению к мутагенному  действию митомицина С показана на клетках   V79 МЯ методом (Han, 1997). Защитный эффект флавоноида кверцетина показан на лимфобластоидных клетках WIL2-NS. Обнаружено снижение индуцированных перекисью водорода уровня МЯ (Saito et al., 2004).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Материалы и методы 
   

Исследованное соединение

В работе исследовался новый радиопротектор  2-пиридин-карбоксальдегид-триптофанат (M 331.42)

 

Клеточная линия KCL22 

KCL22 это клеточная линия хронической миелоидной лейкемии человека в бластном кризе. Линия получена в 1981 году от 32-летней женщины с ХМЛ в бластном кризе с филадельфийской хромосомой. Клетки содержат слияние генов t(9;22) b2-a2 и мутацию p53.

Морфология  клеток: круглые, единичные клетки в  суспензии, иногда в маленьких кластерах.

Культуральная среда: 90% RPMI 1640 + 10% FBS

Условия инкубации: при  37 °C с 5% CO₂

Время удваивания:  »24 часа 

Хранение: в  замороженном виде в 70% среде, 20% FBS, 10% DMSO.

Цитогенетичекая характеристика: гипердиплоидная линия  с 3.3% полиплоидности – 51 (47-51)<2n>X, -X, +1, +6, +8, +8, +14, +22, del(1)(p22), t(9;22)(q34;q11), add(17)(p12-13), i(21q), der(22)t(9;22)(q34;q11).

Молекулярная  генетика: присутствует слияние генов BCR-ABL (b2-a2).

                                                                                    

Анализ  генотиксичности с использованием МЯ теста с блокированием цитокинеза 

Для анализа генотоксичности нового радиопротектора  2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ) применялся МЯ тест с блокированием  цитокинеза (Fenech, 2003) Клетки линии KCL-22 культивировали в течение 24-48 часов после посева и затем обрабатывали тестируемыми препаратами в течение 44-48 часов. Во всех вариантах опытов использовали по две клеточные культуры. За 36 часов до фиксации клеток в культуры добавляли ингибитор цитокинеза цитохалазин В в дозе 3 мкг/мл. Суспензию клеток фиксировали смесью этанол: уксусная кислота (3: 1), наносили на предметные стекла, высушивали и окрашивали красителем Гимза.

Число микроядер анализировалось  в 1000 двуядерных клеток в двух повторностях.

 

Анализ клеточной пролиферации

На препаратах подсчитывали число  дву- и многоядерных клеток из 1000 клеток и определяли индекс клеточного деления  (NDI, Nuclear Division Index) по формуле

 

NDI = (M1+2(M2)+3(M3)+4(M4))/N

M1-M4- число моно-, би-, трех-, четерехядерных клеток

N-общее число клеток

 

Полученные результаты сравнивались по t-критерию. Статистический анализ проводился с применением программы STATGRAPHICS Plus

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Результаты и обсуждение

 

Ионизирующая  радиация генерирует свободные радикалы при прохождении через живые  ткани. Взаимодействие свободных радикалов  с ДНК вызывает генетические повреждения, ведущие к мутагенезу и канцерогенезу (Reily, 1994). Так как ионизирующая радиация применяется в медицинской практике актуальной является разработка эффективных радиомодификаторов.

Проверка  на безопасность включает оценку цитотоксичности  и генотоксичности новых соединений. Генотоксичность нового радиопротектора 2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ)  была проанализирована в  клеточной линии  KCL22 (клетки миелоидной лейкемии человека) с применением МЯ теста с цитокинетическим блоком. Полученные данные представлены в Таблице 1.

В концентрациях  IC50/2 (28 мкм) и IC50/5 (11.2 мкм) (IC50 – это доза, вызывающая гибель 50 % клеток) уровень двуядерных клеток с МЯ на 1000 бинуклеатов повышается от 2.5±0.71 до 6±0.00 и 7.5±0.71, соответственно. В обеих случаях разница с контрольным уровнем является достоверной (p<0.01), однако следует отметить, что сама по себе частота МЯ в экспериментальных вариантах является невысокой, тем более для линии опухолевых клеток. Поэтому 2-ПКАТ можно охарактеризовать как слабый генотоксикант.

Так же показано, что под воздействием 2-ПКАТ в  изученных концентрациях не меняется активность клеточной пролиферации (Таблица 2). Индекс клеточного деления  при обработке 2-ПКАТ в концентрациях 28 мкм (1.62±0.12) и 11.2 мкм (1.47±0.04)  не превышает  контрольный уроыень  (1.61±0.05).

По данным литературы многие вещества с радиопротекторными свойствами (большинство из них нейтрализуют свободные радикалы клетки), сами являются токсичными в дозах, необходимых  для радиозащитного эффекта (Vijayalaxmi et al., 1998).

По данным МЯ теста новый радиопротектор 2-ПКАТ практически безопасен для клеток KCL22. Однако, для окончательного заключения необходима дальнейшая проверка его безопасности на клеточных линиях другого происхождения, а также на нормальных клетках человека.

В работе Kopjar et al. (2006) радиопротекторы амифостин и мелатонин в необлученных лимфоцитах человека повышают контрольный уровень от 7  до 13 и 12 клеток с МЯ на 1000 двуядерных клеток. Интересно, что при совместном применении обоих радиопротектров уровень МЯ в лимфоцитах оставался равным контрольному (7 клеток с МЯ на 1000). Авторы заключают, что оба радиопротекторных соединения не повреждают геном лимфоцитов человека  in vitro.

По нашим  сведениям в литературе нет работ  с применением МЯ теста в клеточной  линии KCL22. По своим цитогенетическим характеристикам клетки KCL22 имеют гипердиплоидный кариотип с 3.3% полиплоидности. Интересно отметить, что несмотря на наличие трисомий по ряду хромосом (1, 6, 8, 14, 22) спонтанный уровень МЯ в KCL22 остается достаточно низким.

 

Таблица 1. Анализ генотоксичности  нового радиопротектора  2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ) в клеточной линии KCL22 МЯ тестом

Концентрация радиопротектора (мкм)	Общее число  двуядерных клеток	Число двуядерных клеток с МЯ	M±SD	Число МЯ	M±SD
28	1000	6	6±0.00*	6	6±0.00*
	1000	6		6
11,2	1000	8	7.5±0.71*	8	7.5±0.71*
	1000	7		7
Контроль	1000	2	2.5±0.71	2	2.5±0.71
	1000	3		3

 

 

Статистически достоверная разница  с контрольным уровнем по t критерию (*p<0.01)

 

 

Таблица 2. Анализ уровня клеточной  пролиферации при действии нового радиопротектора  2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ) в клеточной линии KCL22 МЯ тестом.

 

Концентра-ция 2-ПКАТ (мкм)	Всего клеток	Число  одно- ядерных клеток	Число  дву- ядерных клеток	Число  трех- ядерных клеток	Число  четырех- ядерных клеток	Индекс клеточного деления	M±SD
28	1000	401	585	12	2	1.62	1.62±0.12
	1000	384	604	8	4	1.63
11,2	1000	565	425	10	0	1.45	1.47±0.04
	1000	505	495	0	0	1.50
Контроль	1000	359	633	6	2	1.65	1.61±0.05
	1000	440	552	8	0	1.57

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Выводы

 

Результаты оценки генотоксичности  нового радиопротектора  2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ) и анализ уровня клеточной пролиферации в клеточной линии KCL22 с применением МЯ теста с блокированием цитокинеза позволяют сделать следующие выводы:

1. Спонтанный уровень МЯ в клеточной  линии KCL22 является низким (2.5±0.71) несмотря на наличие в кариотипе трисомий по некоторым хромосомам, следовательно нестабильность кариотипа клеток не отражается на формировании МЯ.
2. 2-ПКАТ не влияет на активность клеточного деления в линии KCL22.
3. 2-пиридин-карбоксальдегид-триптофанат в концентрациях IC50/2 и IC50/5 достоверно повышает уровень МЯ (6±0.00 и 7.5±0.71), в двуядерных клетках по сравнению с контрольным значением. Однако подобное повышение находится в допустимых границах для веществ с потенциальными радиопротекторными свойствами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература

 

1. El-Zein R.A., Schabath M.B., Etzel .CJ., Lopez M.S., Franklin J.D., Spitz M.R. Cytokinesis-blocked micronucleus assay as a novel biomarker for lung cancer risk // Cancer. Res. - 2006. - V. 66. - № 12. - Р. 6449-6456.
2. Benites C.I., Amado L.L., Vianna R.A., Martino-Roth Mda G. Micronucleus test on gas station attendants // Genet. Mol. Res. - 2006. - V. 5. - № 1. - Р. 45-54.
3. Godderis L., Aka P., Mateuca R., Kirsch-Volders M., Lison D., Veulemans H. Dose-dependent influence of genetic polymorphisms on DNA damage induced by styrene oxide, ethylene oxide and gamma-radiation // Toxicology. - 2006. - V. 219. - № 1-3. - Р. 220-229. 
4. Voitovich A.M., Afonin V.Y., Krupnova E.V., Trusova V.D., Dromashko E.S. The level of aberrant cells in various tissues of bank vole depending on doses and radionuclide balance in organism // Tsitol. Genet. - 2003. - V. 37. - № 4. - Р.10-15.
5. Pawitan J.A., Suryono I.A. Sensitivity and specificity of the micronucleus test in hypotonic-swollen mononuclear leukocytes compared to the micronucleus test in binucleated lymphocytes to assess chromosomal breaks // Anal. Quant. Cytol. Histol. - 2006. - № 3. - Р. 175-180.
6. Moore F.R., Urda G.A., Krishna G., Theiss J.C. An in vivo/in vitro method for assessing micronucleus and chromosome aberration induction in rat bone marrow and spleen. 1. Studies with cyclophosphamide // Mutat. Res. - 1995. - V. 335. - № 2. - Р. 191-199.
7. Захидов С.Т., Гопко А.В., Семенова М.Л., Михалева Я.Ю., Макаров А.А., Кулибин А.Ю Карнозин как фактор, модифицирующий частоту встречаемости генетически аномальных половых клеток в семенниках ускоренно стареющих мышей SAM // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134. - № 7.- С. 89. 
8. Fabre T., Belloc F., Dupuy B., Schappacher M., Soum A., Bertrand-Barat J., Baquey C., Durandeau A. Polymorphonuclear cell apoptosis in exudates generated by polymers // J. Biomed. Mater. Res. - 1999. - V. 44. - № 4. - Р. 429-435.
9. Goel H.C., Agrawala P.K., Pathania V., Malhotra N. Immunomodulatory and cytoprotective role of RP-1 in gamma-irradiated mice // Mol. Cell. Biochem. - 2003. - V. 254. - № 1-2. - Р. 73-81.
10. Dominici L, Cerbone B, Villarini M, Fatigoni C, Moretti M. 2010 Jul. In vitro testing for genotoxicity of indigo naturalis assessed by micronucleus test. Nat Prod Commun 5(7):1039-42.
11. Kayani MA, Parry JM. 2010 Feb. The in vitro genotoxicity of ethanol and acetaldehyde. Toxicol In Vitro 24(1):56-60. Epub 2009 Sep 9.
12. Humpage AR, Fenech M, Thomas P, Falconer IR.  2000 Dec 20. Micronucleus induction and chromosome loss in transformed human white cells indicate clastogenic and aneugenic action of the cyanobacterial toxin, cylindrospermopsin. Mutat Res.;472(1-2):155-61. 
13. Bull CF, Beetstra-Hill S, Benassi-Evans BJ, Crott JW, Kimura M, Teo T, Wu J, Fenech MF. 2011 Jan. Application and adaptation of the in vitro micronucleus assay for the assessment of nutritional requirements of cells for DNA damage prevention. Mutagenesis.;26(1):193-7. 
14. Sharif R, Thomas P, Zalewski P, Graham RD, Fenech M. 2011 Feb 28. The effect of zinc sulphate and zinc carnosine on genome stability and cytotoxicity in the WIL2-NS human lymphoblastoid cell line. Mutat Res.;720(1-2):22-33. Epub 2010 Dec 15.
15. Reily PA. 1994. Free radicalsin biology: Oxidative stress and the effect of ionizing radiation. Int J Radiat Biol 65:27-33
16. Hosseinimehr SJ, Nemati A. 2006. Radioprotective effects of hesperidin against gamma irradiation in mouse bone marrow cells. Br J Radiol 79:415-418.
17. Hosseinimehr SJ, Ahmadi A, Mahmoudzadeh A, Mohamadifar S.2009. Environmental and Molekular Mutagenesis 50:749-752
18. Kopjar N, Miocić S, Ramić S, Milić M, Viculin T. 2006 Jun. Assessment of the radioprotective effects of amifostine and melatonin on human lymphocytes irradiated with gamma-rays in vitro. Arh Hig Rada Toksikol 57(2):155-63.
19. Rithidech KN, Tungjai M, Whorton EB. 2005 Aug 1. Protective effect of apigenin on radiation-induced chromosomal damage in human lymphocytes. Mutat Res 585(1-2):96-104.
20. Lee TK, Allison RR, O'Brien KF, Khazanie PG, Johnke RM, Brown R, Bloch RM, Tate ML, Dobbs LJ, Kragel PJ. 2004 Jan. Ginseng reduces the micronuclei yield in lymphocytes after irradiation.Mutat Res. 10;557(1):75-84.
21. Srinivasan M, Devipriya N, Kalpana KB, Menon VP.  2009 Jul 28. Lycopene: An antioxidant and radioprotector against gamma-radiation-induced cellular damages in cultured human lymphocytes. Toxicology.;262(1):43-9. Epub 2009 May 18.
22. Han C. 1997 Mar 19. Screening of anticarcinogenic ingredients in tea polyphenols. Cancer Lett.;114(1-2):153-8.
23. Saito A, Sugisawa A, Umegaki K, Sunagawa H. 2004 Feb. Protective effects of quercetin and its metabolites on H2O2-induced chromosomal damage to WIL2-NS cells. Biosci Biotechnol Biochem.;68(2):271-6.
24. Vijayalaxmi, Reiter RJ, Meltz ML, Herman TS. Melatonin: possible mechanisms involved in its ‘radioprotective’ effect. Mutat Res 1998;404:187-9.