Оценка генотоксичности нового радиопротектора микроядерным тестом в клеточной линии KCL22

Содержание

 

Введение............................................................................................................ 3

1. Обзор литературы...................................................................................... 4

1.1 Аспекты формирования микроядер................................................................ 4

1.2 МЯ тест с блокированием  цитокинеза........................................................... 6

1.3 Применение МЯ теста в генетической  токсикологии................................... 8

1.4 Общая  характеристика  радиопротекторов................................................... 9

1.5 Применение МЯ теста для  оценки радиопротекторных соединений........ 11

2. Материалы и методы............................................................................... 13
3. Результаты и обсуждение....................................................................... 15
4. Выводы....................................................................................................... 16

Литература...................................................................................................... 17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Ионизирующая  радиация генерирует свободные радикалы при прохождении через живые  ткани. Взаимодействие свободных радикалов  с ДНК вызывает генетические повреждения, ведущие к мутагенезу и канцерогенезу. Очевидна  необходимость  разработки эффективных соединений с радиопротекторными свойствами  с целью защиты человека от воздействия ионизирующих излучений  в связи с  их применением в  медицинской практике, а также  при  ликвидации  последствий  аварий на атомных установках.

Радиозащитные  вещества  могут сами быть высокотоксичными  и могут  вызывать негативные  побочные  реакции. Поэтому перед  внедрением в приактику новых  соединений необходимо их тестирование на цитотоксичность и генотоксичность.

Поскольку радиоактивное  излучение индуцирует появление  клеток, содержащих микроядра, то микроядерный тест может быть с успехом использован  для контроля эффективности радиопротекторов. Во многих исследованиях соединений с радиопротекторными свойствами применяется  МЯ тест, который позволяет быстро и эффективно оценивать повреждения  хромосом. Модификация МЯ теста с  цитокинетическим блоком позволяет  одновременно оценивать активность клеточного деления.

Целью настоящей работы была оценка генотксичности нового радиопротектора 2-пиридин-карбоксальдегид-триптофаната (2-ПКАТ) в клеточной линии KCL22 с применением МЯ теста с цитокинетическим блоком.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Оценка уровня МЯ, индуцированных 2-ПКАТ в клеточной линии KCL2 в двух концентрациях IC50/2 и IC50/5

2. Оценка индекса клеточного  деления в клетках KCL22 при действии 2-ПКАТ в двух концентрациях IC50/2 и IC50/5

3. Оценка спонтанного уровня  МЯ в клеточной линии KCL22.

 

 

 

 

1. Обзор литературы
1. Аспекты формирования микроядер

 

Актуальность  исследований, включающих идентификацию  и регистрацию клеток, имеющих  в своем составе микроядра (МЯ) объясняется тем, что данные структуры  часто встречаются при различных  заболеваниях (El-Zein et al., 2006), а также возникают под влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды. Численность клеток с микроядрами возрастает при воздействии как химических соединений (Benites et al., 2006), так и радиации (Godderis et al., 2006). В связи с этим МЯ тест с успехом используется  в качестве своеобразного маркера патологических изменений в организме.

Известно, что  микроядра представляют собой небольшие  образования, состоящие из целых  хромосом и их фрагментов. На стадии телофазы фрагменты хромосом могут  включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или  множественные микроядра в цитоплазме (Рис. 1) (El-Zein et al., 2006). Крупные микроядра формируются при патологических митозах, что обусловлено отставанием отдельных хромосом в метафазе и в анафазе, в то время как мелкие микроядра встречаются преимущественно при структурных аберрациях хромосом. Кроме того, микроядра могут появляться вследствие апоптоза. При апоптозе могут встречаться микроядра различного размера, что связано с фрагментацией ядра клетки, подверженной этому процессу Указанные процессы, лежащие в основе образования микроядер, несомненно, свидетельствуют о снижении жизнеспособности таких клеток, что является маркером нестабильности их функционирования, активизации процессов воспаления и апоптоза (Voitovich et al., 2003). Исходя из этого, можно предположить, что крупные микроядра будут образовываться при действии на организм различных мутагенов, а мелкие свидетельствовать о наличии хромосомных аберраций, например при старении организма, и указывать на снижение потенциальной возможности клеток к регенерации и репарации. 

 

Рис. 1. Образование микроядер

 

К наиболее важными показателями, определяющими  степень влияния различных факторов на клетки, относят результаты микроядерного  теста, хромосомный анализ и уровень  митотической активности. Микроядерный тест является косвенным методом  оценки наличия хромосомных повреждений. Например, определение микроядер  в лейкоцитах зарекомендовало себя в качестве специфичного и высокоинформативного способа идентификации разрывов хромосом (Pawitan et al., 2006). На основании данных, полученных при исследованиях in vivo и in vitro, было установлено, что показатель, характеризующий появление микроядер в ряде случаев может быть даже более информативным, чем регистрация хромосомных аберраций (Moore et al., 1995). 
 Количество клеток с микроядрами зависит от генотипа организма (Захидов и др., 2002). Повреждение хромосом и формирование микроядер наблюдается при различных генетических аномалиях, в частности, при новообразованиях, что дает возможность применения микроядерного теста для прогнозирования онкологических заболеваний (El-Zein et al., 2006 ).

Изменение количества клеток с микроядрами учитывается  не только при оценке химических  и физическтх мутагенов, но и при  исследованиях эффективности воздействия  протекторов, защищающих организм от влияния  токсических веществ (Fabre et al., 1999).

При анализе  микроядер, индуцированных  действием  радиации, выявлено, что в различных  типах клеток отмечается разная интенсивность  формирования микроядер в ответ  на ее воздействие (Voitovich et al., 2003). Поскольку радиоактивное излучение индуцирует появление клеток, содержащих микроядра, то микроядерный тест может быть с успехом использован для контроля эффективности радиопротекторов в экспериментальной практике (Goel et al., 2003).

Экспериментальная практика тестирования фармакологических  препаратов и других химических соединений не обходится без микроядерного  анализа.

Регистрация структурно-функциональных изменений, при которых в клетках выявляется наличие микроядер, представляет собой высокоинформативный и вместе с тем простой в техническом отношении метод оценки влияния на организм различного рода факторов. На основании вышеизложенного становится очевидной особая значимость микроядерного теста для различных областей практической медицины и исследований теоретического и прикладного характера.

 

 

2.  МЯ тест с блокированием цитокинеза

 

В современной  постановке — с цитокинетическим блоком в присутствии цитохалазина В метод анализа МЯ был разработан относительно недавно — в середине 80-х годов прошлого века.

Микроядерный  тест с цитохалазином В основан  на анализе тех же типов генетических повреждений, что и оценка хромосомных  аберраций, и обладает достоинствами как метафазного, так и ана-телофазного анализов. Но от этих методов его выгодно отличает возможность накапливать клетки, содержащие генетические повреждения.

В исследовательской практике метод  культивирования лимфоцитов крови в условиях цитокинетического блока используют, в основном, в нескольких вариантах постановки:

1. для выявления генотоксических эффектов и изучения механизмов действия как отдельных физических, химических или биологических факторов, так и их сочетаний — на клетках крови здоровых доноров in vitro;
2. для оценки эффектов нестабильности генома, связанных с действием комплексов производственных факторов и факторов окружающей среды;

3) для  изучения особенностей и механизмов  формирования индивидуальной чувствительности  генома человека в норме и  при различных патологиях.

Цитохалазин В (ЦХВ) — представитель группы родственных  по химической структуре продуктов  метаболизма некоторых плесневых  грибов. Является одним из наиболее токсичных представителей класса цитохалазинов, однако традиционно для культивирования  клеток в условиях цитокинетического  блока используется именно он.

Биологические эффекты ЦХВ, как и эффекты  всей группы этих соединений, обусловлены  образованием ковалентной связи  с концом актинового филамента, что  практически полностью блокирует  как дальнейший рост, так и деградацию филамента на этом конце нити. В результате  возникает  блокирование цитокинеза.

  Функционально цитохалазины напоминают кэпирующие белки, сходство с которыми подтверждается тем, что ряд белков конкурирует с ними за связывание с актиновыми филаментами. Цитохалазины широко используются для исследования живых клеток, т.к. они способны проникать через клеточную мембрану. Цитохалазины блокируют расхождение дочерних ядер, образовавшихся в результате ее деления. В этом случае нарушается только цитокинез, но не предшествующие стадии деления, поэтому живая клетка в среде с цитохалазином становится двуядерной, сохраняя потенцию к дальнейшему делению. Именно поэтому присутствие цитохалазина в культуральной среде с быстро делящимися клетками может привести к образованию полиядерных клеток — содержащих 4 и более ядер. Однако без специальных исследований нельзя сказать, одинаково ли содержание ДНК во всех ядрах такой полиядерной клетки. При этом важно понимать, что число ядер в клетке отражает скорость их пролиферации в культуре.Так, присутствие в культуре одноядерных клеток свидетельствует либо о том, что клетка не ответила на митогенный сигнал, либо — особенно если в ней обнаруживается микроядро или внутренний хроматиновый мост — о прохождении ею митоза до добавления цитохалазина В.

Основную часть пролиферативного пула на момент фиксации культуры обычно составляют двуядерные клетки — прошедшие только один митоз за все время культивирования с ЦХВ. Анализ именно этой популяции клеток чаще всего используется для оценки генотоксических эффектов (Рис. 2).

Рис. 2. Микроядро в двуядерной клетке

 

 

3. Применение МЯ теста в генетической токсикологии

 

МЯ тест входит в батарею тестов оценки генотоксичности  потенциальных лекарственных средств, соединений применяемых в косметической  промышленности и пищевых продуктов.

Так, на клеточной  линии гепатоцитов человека HepG2 МЯ тестом показано отсутствие генотоксических свойств применяемого в косметических средствах indigo naturalis (Dominici et al., 2010).

Исследования последних лет доказывают, что этанол, подобно продукту его метаболизма – ацетальдегиду сам способен вызывать повреждения хромосом. Этанол и его метаболит ацетальдегид вызывают достоверное повышение уровня МЯ. Применение кинетохорных иммунофлюоресцентных проб показало, что индуцированные этанолом МЯ имеют анеугенное происхождение, а МЯ,  индуцированные его метаболитом ацетальдегидом, имеют кластогенное происхождение (Kayani, Parry, 2010).

Покзано, что  ингибитор белкового синтеза  сylindrospermopsin, продуцируемый цианобактериями индуцирует МЯ как анеугенного так и кластогенного происхождения в лимфобластоидной клеточной линии человека WIL2-NS. Полученные результаты важны для здоровья человека, так как цианбактерии присутствуют во многих источниках питьевой воды (Humpage et al., 2000).

МЯ тест был  изначально разработан для оценки отдельных  средовых генотоксикантов, но сейчас с  успехом применяется для  оценки действия на ДНК комбинаций питательных  микроэлементов и пищевых продуктов (Bull et al., 2011). Показано, что при дефиците Zn в лимфобластоидной клеточной линии человека WIL2-NS повышается количество МЯ, апоптотических и некротических клеток. При обогащении питательной среды Zn количество геномных повреждений снижается (Sharif et al., 2011). 

 

 

4. Общая  характеристика  радиопротекторов

 

Изучение  соединений с радиопротекторными свойствами проводится  с целью защиты  здоровых тканей при  радиотерапии.  Очевидна  и  необходимость  защиты человека от воздействия ионизирующих излучений  при  ликвидации  последствий аварий на атомных установках. 

Наряду с  радиопротекторами  интерес  радиобиологов  вызывают  вещества  с противоположным  действием — радиосенсибилизаторы.  Одной  из  главных  целей здесь  является изыскание химических соединений, повышающих  чувствительность раковых  клеток к воздействию ионизирующей радиации. Таким образом,  проблемы защиты   здоровых   тканей   с   помощью   радиопротекторов   и    повышение чувствительности   раковых   клеток   к   облучению   путем    использования радиосенсибилизаторов    оказываются     связанными     общностью     задач. Радиопротекторы  и радиосенсибилизаторы вместе  представляют  так  называемые радиомодифицирующие  средства.  Их  комбинированное  использование  открывает новые  возможности для радиотерапии опухолей.

   Радиозащитное действие впервые было описано в  1949  году  исследователем

Паттом. Цистеин, введенный мышам  перед летальным  рентгеновским  облучением,