Мультиплексная ПЦР

 

 

Воронежский Государственный Университет Инженерных Технологий

Технологический факультет

Кафедра Биохимии и Биотехнологии

 

 

 

 

 

Реферат на тему:

«Мультиплексная ПЦР»

Предмет: Молекулярная биология

3 курс

Выполнила  студентка группы ПБ-112

Максимова Юлия Сергеевна

Преподаватель Калаев Владислав Николаевич

 

 

 

 

 

 

Воронеж 2013

СОДЕРЖАНИЕ

 

1 Введение…………………………………………………………………………3

2 Мультиплексная ПЦР, ее сущность……………………………………………4

3 Требования к праймерам мультиплексной ПЦР …………………………......6

4 Проведение на основе анализа предшествующих антител к HLA ………….6

5 Преимущества мультиплексной ПЦР и приложения…………………………7

6 Применение мультиплексной ПЦР

    6.1 Применение в NAT скрининге донорской крови………………………...8

    6.2 Применение в диагностике вирусных нейроинфекций………………….9

5 Заключение……………………………………………………………………..13

6 Список использованной литературы…………………………………………14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод, который позволяет  значительно увеличить малые концентрации определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в пробе.

Автор изобретения ПЦР - Кери Муллис. Он в 1993 году получил  Нобелевскую премию в области химии. Давно был необходим метод, который позволял бы получить неограниченное число копий исходной ДНК или РНК.  В течение нескольких лет  ПЦР использовалась как экспериментальный метод. Её широкое внедрение  в клиническую практику началось в 80-х - 90-х годах.

Существует несколько разновидностей ПЦР, одной из которых является мультиплексная полимеразная цепная реакция.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПЦР

 

В то время как в стандартном методе ПЦР обычно используют одну пару праймеров для амплификации специфической последовательности, в мультиплексном методе ПЦР используется множество пар праймеров для амплификации многих последовательностей одновременно. Наличие в одной пробирке многих ПЦР праймеров может порождать много проблем, таких как увеличение образования продуктов, полученных в результате «неправильной» работы праймера, «димеров праймеров», а также дискриминация амплификации более длинных фрагментов ДНК.

Для этого типа ПЦР амплификации выбирают праймеры с близкой температурой отжига. Длина продуктов для амплификации должна быть также сходной; большая разница в длине целевых ДНК будет способствовать амплификации более коротких целевых последовательностей в ущерб более длинным, и это приведёт к различному уровню выхода продуктов амплификации. В дополнение, буфер для мультиплексного ПЦР содержит добавки для Taq полимеразы, которые уменьшают конкуренцию между ампликонами и дискриминацию более длинных фрагментов ДНК в процессе мультиплексного ПЦР.

Продукты мультиплексного ПЦР можно впоследствии гибридизовать с ген-специфичными зондами для проверки.

Данный метод позволяет проводить несколько реакций для

индикации геномной ДНК разных микроорганизмов одномоментно в одной

пробирке. Такой вариант постановки ПЦР применил в своей работе Jeong

Soon Kim  (Южная Корея) для идентификации в мясных продуктах

бактерий видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria

monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp.

 

Мультиплексная ПЦР - одновременная амплификация нескольких участков матричной ДНК. Её удобно проводить в ряде случаев. Добавляя в реакционную смесь меченые dNTP, получаем меченые продукты ПЦР. Также внимания заслуживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК (комплементарной ДНК). На этой основе выявлены методы анализа экспрессии генов и получения больших количеств кДНК. Следует заметить, что реакцию амплификации проводят не только в растворах, а непосредственно и на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRTNS – полимеразная реакция на месте).

Небольшие размеры синтезируемых молекул, возможность специфичного и точного выбора участка ДНК для амплификации, их большое количество сильно облегчают молекулярный анализ продуктов ПЦР. Амплифицированную ДНК можно наблюдать в проходящем ультрафиолетовом свете в виде красной полосы после электрофоретического концентрирования и обычного окрашивания геля бромидом этидия. Также возможна идентификация этих молекул путем блот-гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами. При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза количество и положение окрашенных полос на геле изменяются в соответствии с положением этих сайтов.

Мультиплексная ПЦР - это перспективная методика, она требует более строгой оптимизации условий, чем стандартная ПЦР с одним ампликоном. Ключ к успеху мультиплексной ПЦР - это правильный подбор параметров реакции (концентрации реагентов и особенностей прохождения каждой стадии), позволяющий всем праймерам соединяться с комплементарными им матрицами и синхронно наращивать ампликоны. Подбор правильных праймеров, ферментов и буфера также является важным фактором, определяющим эффективность мультиплексной ПЦР.

 

 

 

ТРЕБОВАНИЯ К ПРАЙМЕРАМ ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

 

Для успешной мультиплексной реакции важны определённые условия. Требования к праймерам, описанные ниже, являются ключом к проведению мультиплексной ПЦР.

1. Длина праймера

Мультиплексная ПЦР вовлекает большое количество праймеров. Они должны иметь соответствующую длину. Обычно праймеры - короткие отрезки, в диапазоне 18-22 пар оснований.

2. Температура отжига.

Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4-5 ° С ниже их температуры плавления. В мультиплексной ПЦР участвуют праймеры с температурой отжига 55°C - 60°C. Для последовательностей с высоким содержанием гуанин-цитозина рекомендуются праймеры с более высокой температурой отжига (75°C - 80°C).

3. Следует избегать формирования «димеров праймеров».

Димеризация приводит к неопределенному увеличению. 

 

ПРОВЕДЕНИЕ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПРЕДШЕСТВУЮЩИХ АНТИТЕЛ К HLA КЛАССОВ I И II

 

 

Название HLA  - антигены было дано в связи с тем, что эти молекулы наиболее полно представлены именно на поверхности лейкоцитов; каждый человек обладает индивидуальным набором HLA - антигенов.

При мультиплексном анализе на твердой подложке можно разместить большое количество зондов, что позволяет провести исследование образца одновременно по множеству параметров. В качестве примера можно привести систему DynaChip производства Dynal (Invitragen) для скрининга на предсуществующие антитела к HLA I и II-ого классов, необходимому при подборе доноров для трансплантации. Белки упорядоченно размещаются на подложке, образуя чип. Каждый чип размещается в лунке стрипованного микропланшета. Процедура аналогична стандартному ИФА (Иммуноферментный анализ) и позволяет использовать автоматический анализатор.

Таким образом, при полной загрузке менее чем за 3 часа можно в автоматическом режиме исследовать 96 образцов сыворотки (объём пробы 8 мкл) на репрезентативную панель предшествующих антител.

 

ПРЕИМУЩЕСТВА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

 
Из практики лабораторных исследований известно, что мультиплексная ПЦР имеет ряд преимуществ перед стандартной ПЦР:

1. Снижение риска контаминации  образца 

2. Возможность контроля ложноотрицательных  результатов

3. Уменьшение расхода реактивов

4. Сокращение времени подготовки

5. Более высокое качество эталона, количество которого можно определить  в образце

НЕДОСТАТОК МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

Однако, несмотря на явные преимущества, мультиплексная ПЦР требует длительной оптимизации протокола (подбор температур отжига праймеров, концентрации реактивов, параметров амплификации), что ограничивает ее широкое применение.

ПРИЛОЖЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР 
1. Идентификация возбудителя 
2. Высокая пропускная способность SNP генотипирования  
3. Анализ мутаций 
4. Анализ удаленного гена 
5. Определение матриц 
6. Анализ сцепливания 
7. Обнаружение РНК 
8. Судебно-медицинские исследования

 

ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

 

Метод мультиплексной ПЦР применяется в диагностике вирусных нейроинфекций, в диагностике респираторно-вирусных инфекций, в диагностике урогенитальных инфекций, в NAT-скрининге донорской крови. Подробно рассмотрим только две области применения.

Применение метода мультиплексной ПЦР в NAT скрининге донорской крови

Свойство метода ПЦР, которое позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента в любой биотической среде, сделало возможным его использование в скрининге донорской крови человека на ВГС, ВИЧ, ВГВ. Необходимость его применения в службе крови связана с неизбежными ограничениями обязательного обследования крови доноров методом ИФА на серологические маркеры гемотрансмиссивных инфекций: ВИЧ-антигена р24 и антител к  ВИЧ, HBs-антиген, антитела к вирусу гепатита C. Ограничения основаны на невозможности обнаружения вирусов в период ранней инфекции, в период так называемого «иммунологического окна». При поддержке FDA в США в 1999 г. был введен новый метод скрининга донорской крови на основе амплификации нуклеиновых кислот (NAT).

В разных странах выявляют доноров с виремией, но без серологических признаков гемотрансмиссивной инфекции. Период "иммунологического окна" можно уменьшить, применяя амплифицирующие методы. ИФА - скрининг донорской крови на маркеры ВГС, ВГВ, ВИЧ во всем мире является обязательным, а в странах Европы, Новой Зеландии, Японии, Австралии, Гонконге, Сингапуре кровь и плазма дополнительно подвергается NAT - скринингу с целью выбраковки донаций, полученных от доноров, которые находятся  в периоде "иммунологического окна". В настоящее время разработаны различные методики NAT детекции ВИЧ, RFC и ВГВ донорской крови. Системы имеют одиночный и мультиплексный форматы. Одиночный формат - детектируют один тип вируса. Имеет значительные преимущества одновременная детекция нескольких вирусных агентов: во времени, которое необходимо для скрининга миллионов образцов донорской крови, в стоимости этого скрининга, если сравнивать с методиками выявления одного вирусного агента.

Полностью автоматизированные (роботизированные) NAT системы скрининга донорской крови, которые позволяют за короткое время, с высокой чувствительностью и специфичностью проверить большое количество образцов на ВГС, ВГВ  ВИЧ, являются коммерчески доступными и были разработаны на основе мультиплексного ПЦР. Также были разработаны менее дорогие и зависящие от приборного обеспечения системы, которые позволяют провести анализ на месте. Ежегодно в мире проводится примерно 90 миллионов донаций крови и ее компонентов, из них 3.7 млн. – в России. Около половины донаций на планете обследуется методами амплификации нуклеиновых кислот.

Применение мультиплексной ПЦР в диагностике вирусных нейроинфекций

 

Известно примерно 100 вирусов, которые поражают центральную нервную систему и приводят к различным неврологическим заболеваниям. Вирусные неврологические заболевания клинически делятся на острые (асептический менингит, слабый паралич, энцефалит, постинфекционный энцефаломиелит) и хронические. Острые заболевания вызываются группой Herpesviridae, Picornaviridae (энтеровирусы), Paramyxoviridae, некоторыми представителями семейства Rhabdoviridae, Togaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae. Представителем семейства Paramyxoviridae - вирусом кори, Papovaviridae -JC и ВК вирусами вызываются хронические неврологические заболевания.

Лечение вирусных энцефалитов имеет много сходных черт, ввиду общности их патогенетических механизмов, но различается в зависимости от этиологического агента, вызвавшего заболевание. Этиотропная терапия вирусных поражений нервной системы вызываемых вирусами герпеса ограничена группой нейроинфекций. Самые распространённые и наиболее тяжёлые - это нейроинфекции. Герпесный энцефалит (ГЭ) – самая распространенная причина спорадических острых энцефалитов, как в США, так и в Европе. В США ежегодно регистрируется около 2000 случаев. Около 90% случаев герпесных энцефалитов у взрослых - результат инфекции ВПГ-1 (вирус простого герпеса первого типа) Высокую эффективность лечение нейроинфекций имеет в настоящее время. При малейшем подозрении на герпетическую природу энцефалита часто назначают ацикловир, он более эффективен для лечения. Лечение цитомегаловирусных поражений головного мозга проводится фоскарнетом и ганцикловиром. Адекватная терапия требует от врача быстрой дифференциальной диагностики сходных по клиническим проявлениям заболеваний.

Выделение ВПГ биопсии из мозговой ткани является стандартом для ГЭ. Через 1-2 дня получают ответы посевов. В большинстве случаев культивирование вирусов из спинномозговой жидкости (СМЖ) не эффективно. Кроме того, культивирование вирусов из СМЖ для большинства других вирусов поражающих ЦНС не эффективно. Представители группы энтеровирусов составляют исключение. Одной из наиболее острых проблем клинической нейровирусологии является поиск быстрых, чувствительных, специфичных тестов для диагностики нейроинфекций. Революционизировала диагностику вирусных инфекций ЦНС новая молекулярная диагностическая технология, такая как полимеразная цепная реакция, она равноценна выделению вируса из мозговой ткани после биопсии по чувствительности и специфичности, но не имеет риска осложнений, сопутствующих биопсии мозга. В связи с приходом диагностики спинномозговой жидкости методом ПЦР сейчас редко применяется биопсия мозга, но всё же она может быть принята во внимание в том случае, если имеются серьезные диагностические сомнения клинические особенности ГЭ, определенные с помощью ПЦР, в основном совпадают с теми, которые были определены для заболеваний ранее, выявленных с помощью выделения вируса после биопсии. В исследованиях методом ПЦР около 15-20% пациентов идентифицируют нетипичные формы ГЭ, что принятыми классическими методами (выделение вируса после биопсии мозга) не распознавалось.