Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы

 

Минисателлиты - поворяющиеся фрагменты ДНК длиной от 7 и более нуклеотидов. Являются одной из разновидностей сателлитной ДНК. Они встречаются более чем в 1000 местах генома человека. Используются в качестве ДНК-маркеров. Механизмами происхождения являются "проскальзывания" при репликации ДНК, точечные мутации и рекомбинация. Минисателлиты состоят из повторяющихся цепочек, преимущественно из вариантов гуанин-цитозин, длиной от 10 до 100 пар оснований.

Теоретически ПЦР открывает  широкие возможности для идентификации тех или иных генов и видов. Все довольно просто. Ищем в геноме участок в котором находится ген, подбираем к этому участку специфическую ипару праймеров, которая комплементарна только искомому участку и вперед. Проводим ПЦР и точно знаем, есть ли искомый ген или нет. Проблема заключается в том, что для того чтобы найти искомый ген, узнать его последовательность, требуется очень много труда, времени, материалов, оборудования, а стало быть – денег.

Методы использующие ПЦР могут иметь различную степень специфичности. Некоторые методики не требуют знания последовательности ДНК, а так как сиквенс (считывание последовательности) интересующего участка довольно дорог и требует хорошего дорогостоящего оборудования, эти методы все еще часто применяются на практике.

К таким методам относится  маркирование по полиморфизму длин продуктов  амплификации.

 

• RAPD маркеры – маркеры получающиеся в результате случайной амплификации ДНК (Williams et al, 1990).
• ISSR маркеры – маркеры основанные на межмикросателитных последовательностях (Zietkiewicz et al, 1994).
• AFLP маркеры – маркеры полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (Vos et al., 1995).

 

AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLP анализ – сложный метод анализа, состоящий из нескольких этапов. В анализе используется праймер с искусственно добавленной последовательностью.

1. Геномная ДНК рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI) с образованием фрагментов с выступающими 3’ – концами.
2. Рестрицированная геномная ДНК легируется с адаптером, содержащим «липкие» концы для данных рестрикционных сайтов.
3. Далее проводятся две последовательные ПЦР: В первой ПЦР используются праймеры полностью комплементарные адаптерам EcoRI и MseI, в результате чего образуется большое количество продуктов амплификации между адаптерами EcoRI и MseI, которые невозможно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому во второй ПЦР праймеры с адаптерами EcoRI и MseI содержат на 3’ – конце дополнительные и некомплементарные адаптерам основания (от 1 до 3) для селективной амплификации.
4. Разделение фрагментов ДНК проводят в полиакриламидном геле с радиоктивной или с флуорисцентной меткой.

Получаемый фингенрпринт ДНК обычно высоко полиморфен и как  правило хорошо воспроизводим.

 

Свойства:

• Полиморфизм AFLP выше, чем RAPD и ISSR.
• Этот метод позволяет определять генетические изменения, вызванные точечными мутациями в сайтах рестрикции или в участках отжига праймеров (присутствие или отсутствие продукта амплификации в спектре) и небольшими вставками и (или) делециями внутри рестрикционного фрагмента (изменение размера полосы в спектре).
• Молекулярно-генетические маркеры легко картируются на хромосомах.

 

ISSR – Inter Simple Sequence Repeat

При ISSR анализе также как и в RAPD используется один или несколько праймеров длиной 15-24 нуклеотида. Праймеры комплементарны повторяющимся участкам генома, таким как микросателлиты.  Микросателлитная ДНК – ДНК из коротких тандемных повторов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями.

 

В данном случае праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3’- конце праймера. Таким образом, продукты  ISSR – амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера.

Выявляемый полиморфизм  с использованием праймеров ISSR более четко воспроизводим, чем в RAPD.

В геномах растений и  животных количество микросателлитных повторов очень велико, что делает этот метод удобным для генетического  анализа. Микросателлитные последовательности окружают многие гены и могут использоваться как якорные последовательности к этим генам.

Свойства:

• Доминантный тип наследования.
• Относительно высокая точность и улучшенная воспроизводимость по сравнению с RAPD в связи с большей длиной праймера и более ысокой температурой отжига.
• Однако локализация в геноме продуктов амплификации, так же как и функция, остаются неизвестными.

 

RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA

RAPD анализ включает  в себя проведение полимеразной  цепной реакции с использованием  одного декануклеотидного праймера с произвольной нуклеотидной последовательностью. Продукты RAPD анализа образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированного инвертированной последовательностью данного праймера.

Свойства:

• Высокая чувствительность к изменениям условий реакций.

• Достаточно низкая температура отжига (37С) - (увеличена вероятность образования продуктов амплификации с большим количеством неспаренных оснований).

• RAPD маркеры ведут себя как доминантные и их гетерозиготное состояние не отличается от гомозиготного, поэтому снижается точность оценки при популяционном анализе и при идентификации генетических ресурсов в сравнении с кодоминантными маркерами.

• Низкая воспроизводимость результатов ПЦР.

• Для повышения достоверности необходима большая выборка.

 

Но все же RAPD анализ может служить своеобразным экспресс - методом выявления генетического  полиморфизма, что особенно актуально  для малоизученных таксономических  групп, а также как источник уникальных локус – специфичных маркеров.

Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных.

 

 

 

 

 

 

 

 

                                Заключение

 

Создание устойчивых к болезням сортов пшеницы и обеспечение длительного сохранения их устойчивости остается актуальной задачей селекции. В связи с этим необходим непрерывный поиск доноров устойчивости взамен утративших эффективность. Требуется проводить дальнейшие анализы, чтобы выявить потенциал всех имеющихся генов, для расширения генетического разнообразия сортов.

Пирамидирование генов, а так же использование для  создания сортов с длительной устойчивостью  эффективных сочетаний генов, утративших эффективность, позволяют значительно повысить генетическое разнообразие сортов и стабилизировать популяции патогена. Успешному переносу этих генов в новые сорта способствуют молекулярные технологии, позволяющие значимо ускорить процесс селекции. В настоящее время маркер-вспомогательная селекция активно используется для переноса генов устойчивости и других хозяйственно-ценных признаков.

 

Библиографический список.

 

1.Анпилогова Л.К., Шаповалова О.Ю., Левашова Г.И., Ваганова О.Ф., Соколов М.С. Теоретические и методологические принципы создания ржавчиноустойчивых сортов пшеницы. Агрохимия, 2002, №5, с.77-88.

 

2.Анпилогова Л.К., Волкова Г.В. Методы создания искусственных инфекционных фонов и оценки сортообразцов пшеницы на устойчивость к вредоносным болезням (фузариозу колоса, ржавчинам, мучнистой росе). РАСХН, ВНИИБЗР. Краснодар, 2000, 28с.

 

3.Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Киселева М.И., Коломиец Т.М., Коваленко Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом // Генетика. 2007. Т. 43. С. 1058-1064.

 

4.Гультяева Е.И., Канюка И.А., Алпатьева Н.В., Баранова О.А., Дмитриев А.П., Павлюшин В.А. Молекулярные подходы в идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у российских сортов пшеницы // Доклады РАСХН. 2009. № 5. С. 23-26.

 

5.Давоян, О. Р.    Получение   и   изучение   замещенных   линий озимой мягкой    пшеницы   Аврора   с   хромосомами  эгилопса   зонтичного  Aegilops umbellulta / И.В. Бебякина, О.Р. Давоян, А.Н. Зинченко // Материалы  Научно-практической    конференции  Кубанского  отделения ВОГиС,  Краснодар, 2009.- С.66-67.

 

6.Давоян, О. Р. Изучение  новых  интрогрессивных  линий   озимой   мягкой пшеницы /  О. Р.   Давоян,  А.Н.  Зинченко,    И.В.  Бебякина  //  Материалы   III Всероссийской научно-практической   конференции  молодых    ученых. - Краснодар, 2009.-С.24-26.

 

 7.Давоян, О. Р. Замещенные   линии     мягкой    пшеницы  с  хромосомами Agropyron glaucum/ А.Н. Зинченко, О. Р.Давоян, И.В. Бебякина // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых.-Краснодар, 2009.- С.33-34.

 

8.Давоян, О. Р.   Передача   устойчивости  к  болезням от  диких  сородичей мягкой   пшеницы  с   использованием     синтетических   форм  / Р.О. Давоян, И.В. Бебякина, О.Р. Давоян,  А.Н. Зинченко, Э.Р.  Давоян// Тр. по прикл. бот. генет. и селекции, 2009.-166.- С.519-523.

 

9.Давоян,  О. Р.      Изучение      устойчивости      к      листовой      ржавчине интрогрессивных линий мягкой пшеницы с генетическим материалом Aegilops umbellulata /О.Р. Давоян, И.В. Бебякина,  Р.О. Давоян, А.Н. Зинченко // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Краснодар, 2010.- С.661-662.

 

10.Давоян, О. Р. Идентификация хромосом Agropyron glaucum у замещенных линий    сорта   мягкой   пшеницы   Аврора /   А.Н. Зинченко, Р.О.  Давоян,  И.В. Бебякина, О.Р.  Давоян // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Краснодар, 2010.-С.665-667.

 

11.Давоян Р.О., Бебякина И.В., Кекало Н.Ю. Получение и изучение замещенных по геному  линий мягкой пшеницы с хромосомами Ae. . umbellulata // Наука Кубани

 

12.Дженин С.В., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Коваленко Е.Д. Доноры устойчивости яровой мягкой пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой росе с генетическим материалом видов Aegilops speltoides L., Aegilops triuncialis L., Triticum kiharae Dorof. et Migusсh. //ДокладыРАСХН. 2009. N 5. С. 3-7.

 

13.Дорохов Д.Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов // Генетика. 1997.- Т. 33.- № 4.- С. 443–450.

 

14.Урбанович О.Ю., Малышев  С.В., Долматович, Картель Н.А. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров // Генетика. 2006. V. 42. С. 675-683.

 

15.Babar M., Mashhadi A.F., Mehvish A. et al. Identification of rust resistance genes Lr10 and Sr9a in Pakistani wheat germplasm using PCR based molecular markers African Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 9(8), pp. 1144-1150

 

16.Greganova Z., Kraic J., Galova Z. Diagnostic of wheat leaf rust resistance genes by DNA markers and their application in mas // Czech J. Genet. Plant Breed. – 2003. – V.39. – P.127–129.

 

17.Davoyan, O. R. Synthetic forms: a basis for preservation and using of a gene pool  of   wild   relatives    of common wheat /  R.O.  Davoyan,  I.V. Bebyakina, E.R. Davoyan, A.M. Kravchenko, O. R. Davoyan//Abstract book Intern. Conference Wheat Genetic  resources  and  genomics, august 28- September 1, 2011, Novosibirsk, Russia, P 37.

 

18.Huerta-Espino J, Singh RP (1994) First report of virulence to wheat with leaf rust resistance gene Lr19 in Mexico. Plant Dis 78:640

 

19.Hung, H.Y., C. Emani, A. Fritz, M. Menz. 2006. Characterization of a                                      gene from Triticum monococcum conferring resistance to leaf rust   (Puccinia triticina ) in wheat. In 2006 Agronomy Abstracts. ASA,   Madison, WI. 

 

  20.Hung, H.Y., C. Emani, A. Fritz, M. Menz. 2006. Detection and     characterization of a leaf rust ( Puccinia Triticina ) resistant   gene from Triticum monococcum in wheat using a PCR based marker. In Plant & Animal Genomes Abstracts. PAG, San Diego, CA.

 

21.Koebner RMD, Kirsch F, Thorpe C, Prins R (1998) AFLPs as a source of STS markers in alien introgression. In: Slinkard AE (ed) Proc 9th Int Wheat Genet Symp, vol 1. University Exten- sion Press, Saskatoon, Canada, pp 118–122

 

22.Koebner RMD, Powell W, Donini P (2001) The contribution of current and forthcoming DNA molecular marker technologies to wheat and barley genetics and breeding. Plant Breed Rev (in press)

 

23.Liu CJ, Chao S, Gale MD (1989) Wsp-1, a set of genes controlling water-soluble proteins in wheat and related species. Genet Res 54:173–181

24.Marais GF (1992a) Gamma-irradiation induced deletions in an alien chromosome segment of the wheat Indis and their use in gene mapping. Genome 35:225–229

 

25.Nelson R.R. Genetics of horizontal resistance to plant disease. Ann.Rev.Phytopathol., 1978, v.16, pp.359-378.

 

 

 

26.Singh R., Tiwari R., Datta D. Detection of Leaf Rust Resistance Genes Lr9 and Lr10 in Wheat (Triticum aestivum) by PCR Based STS Markers //Acta Phytopath et Ent. Hungarica. 2003. V. 38. P. 245-249.

 

27.Stepien L., Golka L., Chelkowski J. Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources // J. Appl. Genet.. 2003. V. 44. P. 139-149.

 

28.Van der Plank J.E. Horizontal (polygenic) and vertical (olygogenic) resistance against blight.  American Potato, 1966, v.43, №2, pp.43-52.

 

29.Wioeniewska H., Stкpieс Ј., Kowalczyk K. Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust // J. Appl. Genet. 44(3), 2003, P. 361-368 

 

30.Wilson J., Shaner G. Slow leaf-rusting resistance  in triticale. Phytopathology, 1987, v.77, №3, pp.458-462.