Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы

Министерство  образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное  бюджетное образовательное

учреждение  высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра генетики микробиологии и биотехнологии

 

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА №1

Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы

 

 

Работу выполнил..............................................................................Попов Фёдор Михайлович

Факультет биологический

Направление 020201 Биология

Научный руководитель…………………………………………..Карасева Эмма Викторовна

Нормоконтролёр…………………………………………..……Вяткина Галина Григорьевна

 

Краснодар 2012

 

 

 

 

Содержание

Введение………………………………………………………………………………………3

1.Аналитический обзор понятия генов устойчивости пшеницы………………………………….…………………………………………...5

2.Методы выявления  генов устойчивости пшеницы………………………………………9

3.Заключение………………………………………………………..………………………16

Библиографический список.……………………………………………………………….17

 

Введение

 

В Северо-Кавказском регионе  ведущее место в севооборотах хлебных злаков занимает озимая пшеница (3500-4500 тыс.га), что обеспечивает до 20 % валового сбора зерна в России. Эта культура подвержена воздействию большого комплекса фитопатогенов, среди которых возбудители бурой (Puccinia triticina Rob.ex Desm. f.sp. tritici Erikss. et Henn.), желтой ржавчины (Puccinia striiformis West. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.), стеблевой ржавчины (Puccinia graminis Pers. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.) занимают преобладающее место.

Интенсификация растениеводства  в современных условиях предусматривает создание генотипов сельскохозяйственных культур, характеризующихся не только высокой продуктивностью, но и устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды. Однако в России в настоящее время насыщенность посевных площадей устойчивыми к болезням генотипами составляет от 7 до 11 %, что примерно в 10 раз ниже мирового уровня. Для оздоровления и стабилизации фитосанитарного состояния агробиоценозов необходимо на должный уровень повысить селекцию устойчивых сортов, способных дать максимальный экономический эффект.

Для разработки научно обоснованной стратегии создания и размещения сортов требуется запас генетически разнообразных доноров устойчивости. Источниками новых доноров могут служить образцы с известными генами устойчивости, представленными в ‹‹Каталоге генных символов…›› (McIntosh et al., 2005, 2010). Традиционными методами идентификации этих генов являются анализ родословной, который позволяет выявить использованный в скрещиваниях источник устойчивости, фитопатологический тест с помощью изолятов, маркированных вирулентностью к идентифицируемому гену, и гибридологический анализ.

Принципиально новые  возможности появились с начала 1990-ч годов с созданием ДНК-маркеров селекционно-ценных признаков. Первый молекулярный маркер был предложен G. Schachermayr с соавторами (1994) для идентификации гена устойчивости к бурой ржавчине. Потребности практической селекции определили усиленное развитие исследований по созданию новых маркеров, в связи с чем список предлагаемых генов ежегодно пополняется. Особую значимость ДНК-маркеры приобрели при идентификации 1) высоко эффективных генов устойчивости, определение которых затруднено из-за отсутствия в популяции патогена вирулентных изолятов; 2) генов устойчивости взрослых растений и 3) малоэффективных генов, получивших широкое использование в стратегиях пирамидирования при создании сортов с неспецифической устойчивостью.

 

Гены устойчивости пшеницы

 

В начале XX века Н. И. Вавилов начал свою научную деятельность с изучения устойчивых к заболеваниям сортов культурных пшениц. Это была задача чрезвычайной важности, так как от фитопаразитов, в частности ржавчины и мучнистой росы, погибает около 30% урожаев пшеницы. Эти болезни вызываются грибами, их распространение в иные годы приводит к эпифитотиям (по аналогии с эпизоотиями и эпидемиями), когда погибает урожай целых регионов. Вавилов предлагал выявлять природные устойчивые сорта и скрещивать их с культурными, высокопродуктивными растениями. В поисках резистентных сортов Вавилов предпринял несколько экспедиций в Центральную Азию, и в этих экспедициях, как мы помним, сформулировал принципы очагов происхождения культурных растений и законы гомологических рядов. Там же, в очагах происхождения, нашлись и резистентные культурные, и дикие сорта. Далее последовала селекционная работа на опытных полях, и в результате удалось вывести целый ряд устойчивых к заболеваниям сортов культурных растений.

За сто лет целенаправленной генетической работы по выведению резистентных сортов культурных растений не изменилась постановка задачи и не снизилась ее актуальность. Зато стали совсем другими методы работы генетиков. Точные прочтения генетических карт выявили множество генов, ответственных за устойчивость к заболеваниям: сейчас известно около ста генов, участвующих в защите растения от ржавчинных грибов. Изучаются биохимические механизмы, ответственные за устойчивость, получена богатая информацию о самом процессе взаимодействия в системе «паразит–хозяин» у культурных растений.

Вся эта информация позволила  различить два типа устойчивости растений к паразитам: вертикальную и горизонтальную. Вертикальная устойчивость основана на точечном механизме защиты, когда растение прицельно разрушает тот или иной белок гриба-паразита. Эта защита получила название «ген-на-ген» (gene-for-gene), то есть против одного гена паразита работает один защитный ген хозяина. Ясно, что этим способом растение конкретной линии или сорта может защититься от одного конкретного заболевания. Такая защита обычно чрезвычайно эффективна, но... недолговечна. Потому что стоит паразиту чуть-чуть изменить свой ген, как белок хозяина уже перестанет его узнавать, и средство защиты оказывается недейственным. Такая вот гонка в поисках «абсолютного оружия». Генетик в данном случае стоит на стороне культурных растений и вынужден всё время настраивать генетическую защиту: искать или конструировать новые гены, вести селекцию или внедрять сконструированные эффективные гены в геном растений. Всё это кропотливая, долгая и дорогостоящая работа.

Но есть другой тип  устойчивости к заболеваниям — горизонтальный. И сами растения пользуются именно этим способом, так как он более надежен и стабилен и работает против нескольких вредителей. Ведь, несмотря на тысячелетия своей вредоносной деятельности, ржавчинные грибы всё же не истребили культурные пшеницы. Стабильная защита обеспечивается множеством генов, хотя этот комплекс не означает стопроцентно здоровых урожаев. Определенная часть листьев всё же поражается грибом, какая-то часть растений всё же отмирает. Поэтому этот тип защиты называется еще количественным. На сегодняшний день известен ряд генов, принимающих участие в горизонтальной резистентности. Среди них гены хорошо известного семейства Lr (leaf rust — листовая ржавчина), которые работают как у проростков, так и у взрослых растений. Количественную, или горизонтальную, устойчивость обеспечивают также гены Yr (yellow rust — желтая ржавчина), Pm (powdery mildew — мучнистая роса) и др. Механизм количественной защиты пока неясен. Актуальность его выяснения очевидна.

Выяснению механизма количественной защиты посвящены работы в последнем выпуске журнала  Science. Одна из них, выполненная учеными из США и Израиля под руководством Даолин Фу (Daolin Fu) и Хорхе Дубковски (Jorge Dubcovsky) с кафедры ботаники Калифорнийского университета в Дэвисе, дает информацию о работе гена из семейства Yr. Другая, выполненная международной командой из Цюрихского университета (Швейцария), научно-промышленной исследовательской организации CSIRO Plant Industry (Канберра, Австралия) и Международного центра по разведению кукурузы и пшеницы (Мехико, Мексика), раскрывает механизм работы одного гена из семейства Lr.

Ген Lr34, ставший объектом внимания швейцарско-австралийско-мексиканской командой генетиков, экспрессируется и у зародышей, и у взрослых растений в листьях. Но в основном его экспрессия в листьях взрослых растений обеспечивает устойчивость от ржавчинных грибов. Генетики изучили нуклеотидную последовательность и структуру локуса, к которому принадлежит этот ген, и выдвинули вполне приемлемую гипотезу о его работе в клетке. Они предположили, что ген Lr34 кодирует белок, который транспортирует через мембрану различные молекулы. Похожий белок (PEN3) имеется и у знаменитого арабидопсиса. PEN3, так же как и LR34, выполняет функцию транспорта через мембрану и придает резистентность к возбудителю мучнистой росы. У арабидопсиса при заражении мучнистой росой PEN3 снижает транспорт растительных метаболитов.

Количественный локус Yr36, исследованный параллельно американо-израильской группой ботаников, регулирует в растительной клетке транспорт фосфолипидов через мембраны. Это означает, что данный локус выполняет сигнальные функции и важен для опознания вредоносных паразитов, контактирующих с клеткой. Ведь своевременное распознавание паразита приводит к быстрому иммунному ответу и улучшению защитных свойств сорта.

Почему паразиты не совершенствуют методы обмана генов горизонтальной защиты? Во-первых, горизонтальная защита может основываться на коллективной работе многих локусов, паразитам трудно обмануть сразу всех. Именно поэтому селекционеры используют новые сочетания этих генов для поддержания устойчивости. (Кстати, само по себе наличие гена Lr34 у растения может и не означать резистентности сорта к заболеванию.) Во-вторых, стабильная защита может быть нацелена на столь важный ген у паразита, что паразиту проще пожертвовать частью вирулентности, чем изменять этот ключевой ген. В-третьих, растение может использовать такие способы защиты, которые не снижают приспособленности и выживаемости паразита. Иными словами, эти способы лишь повышают сопротивляемость заболеванию и болезнь наносит растению меньший вред.

Ясно, что надежные и  долговременные способы борьбы с  фитозаболеваниями должны эксплуатировать  эти последние сценарии, а не ставшие  уже привычными средства «ген-на-ген». А для этого необходимо изучать механизмы горизонтальной устойчивости, благо, как показали последние исследования, средства для этого у современной науки имеются.

 

 

Методы для выявления генов  устойчивости пшеницы

 

Для начала следует рассказать о ДНК. Наш геном, как и геном любого живого организма, за исключением прионов, закодирован в нуклеиновой кислоте. Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры из нуклеотидов. В ДНК существует 4 вида мономеров, т.е. нуклеотидов, Аденин, Гуанин, Цитозин, Тимин. В их последовательности зашифрована вся информация о первичной структуре белка. Белки состоят из 22 аминокислот. Для того, чтобы закодировать 22 аминокислоты при помощи 4-х нуклеотидов, необходимо считывать их не единично, а по 3. 4 в третьей степени получается 64 варианта – вполне достаточно чтобы закодировать 22 аминокислоты. Таким образом , ДНК содержит информацию о первичной структуре белка. Молекула ДНК у эукариот двухцепочечная. Это достигается благодаря тому, что аденин комплементарен тимину, а гуанин – цитозину.

 

Полимеразная цепная реакция была открыта Кэрри Мюллисом в 1983 году. Она позволяет получить миллионы копий (амплифицировать) интересующего участка ДНК.

Для проведения ПЦР в простейшем случает требуются следующие  компоненты:

•ДНК-матрица, содержащаятот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

•Два праймера, комплементарные  противоположным концам требуемого фрагмента ДНК.

•Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов – Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pirococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pirococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

•Дезоксирибонуклеотидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

•Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

•Буферный раствор,обеспечивающий необходимые  условия реакции – pH, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Для того, чтобы прошла реакция, необходимо двухцепочечную ДНК разделить на 2 комплементарных нити. Это достигается путём нагрева рабочей смеси до 93-95 градусов. Далее необходимо ‹‹присоединить›› праймеры к комплементарным участкам. Для этого нужно снизить температуру до такого уровня, при которм праймер сможет ‹‹прикрепиться›› к комплементарному участку. Такая температура называется температурой ‹‹отжига››, её можно рассчитать по формуле:

t = (A+T)x2 + (G+C)x4 – 5C

После того, как праймер прикрепился  к нужному участку, ставится оптимальная температура для работы Taq-полимеразы. Она равна 72 градусам. Следующим шагом будет повторная денатурация ДНК при 93-95 градусах. Допустим, у нас была изначально всего одна ДНК, если мы проведем 35 вышеописанных циклов, мы получим: 1х2³⁴=17179869184 копии.

Для того, чтобы визуализировать  результатыпроведенной реакции, обычно используют электрофорез. Что такое электрофорез? Разделение чего-либо с помощью электрического тока. Электрофорез проводят в геле. Гель может быть агарозным, или акриламидным. Гель делают не на основе дистиллированной воды, а на основе раствора электролитов (солей и кислот), как правило это трис-HCL, борная кислота и ЭДТА. Электролиты служат проводниками электрического тока. Так-как молекулы ДНК заряжены отрицательно, они начинают двигаться в сторону катода. Но, гель представляет для молекул довольно мощную преграду, чем они крупнее по своему размеру, тем труднее им продираться через слой молекул геля. Таким образом, более мелкие молекулы (50 bp) за час электрофореза успевают пройти несколько сантиметров, а более крупные (1000 bp), проходят от силы пару сантиметров. Мы не можем наблюдать ДНК, если ничем её не окрасить. Чтобы её было видно,используют бромистый этидий или импрегнируют серебром. Бромистый этидий кроме того, что активно связывается с молекулами ДНК, ещё и светится в ультрафиолетовом свете.

 

Сателлитная ДНК

 

Микросателлиты -  (или простые короткие (тандемные) повторы) — варьирующие участки (локусы) в ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из повторяющихся фрагментов длиной от 1 до 6 пар оснований. Используются как молекулярные маркеры в определении родства, принадлежности к конкретной популяции, для исследования гибридизации. Микросателлиты характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Представляют собой одну из разновидностей сателлитной ДНК. Микросателлитные последовательности небольшой длины, называемые короткими тандемными повторами (2-6 нуклеотидов, от. англ. STR — short tandem repeats), используются при картировании геномов в работе с редкими видами.