МикроРНК в диагностике и прогнозе развития злокачественных новообразований

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения  малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.

Для количественного  определения микроРНК наиболее часто  используют два метода — флуоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК (SYBR Green I) и модифицированные дезоксинуклеотиды, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК (TaqMan Assay).

1. Выщепление 5'-концевой  метки (TaqMan Assay).

Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (рисунок 2).

Рисунок 2 – Принцип детекции продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием выщепления 5'-концевой метки

В ходе ПЦР во время  стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной  цепи ДНК, причем, чем больше продуктов  амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.

2. Использование интеркалирующих агентов.

Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция SYBR Green I значительно возрастает при его внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации (рисунок 3).

Рисунок 3 – Принцип детекции продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием интеркалирующих агентов

Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции  может быть связано как с накоплением  специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения  корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления".

Для этого после окончания  ПЦР реакционную смесь нагревают  и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления  продукта амплификации флуоресценция  резко снижается. Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа (рисунок 4).

Рисунок 4 –  Кривая плавления: зависимость интенсивности  флуоресценции от температуры

Следует отметить, что использование ДНК-зондов является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена.

Таким образом, порядок проведения анализа микроРНК с использованием метода ПЦР в реальном времени включает:

1. Выделение  мРНК, включающей фракцию микроРНК из биологического материала.

2. Синтез кДНК (метод ОТ-ПЦР).

3. Постановка ПЦР в реальном времени.

4. Построение  кривых плавления (при использовании  интеркалирующих агентов).

5. Анализ и  учет полученных результатов.

Анализ с использованием ПЦР в реальном времени находит в настоящее время широкое применение на практике. Он отличается универсальностью, высокой чувствительностью и специфичностью. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Полученная информация может быть использована для проведения мониторинга эффективности проводимой терапии, оценки клинического прогноза [8].

4.2 Метод  ДНК-микрочипов

Впервые ДНК-микрочипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип детекции мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК.

ДНК-чип представляет собой твердую подложку (стеклянная, пластиковая, кремневая пластинка, нейлоновая мембрана) площадью от 0,1 до 10 см², на которую нанесены от нескольких десятков до нескольких тысяч ячеек с иммобилизованными (как правило, ковалентно) однонитевыми фрагментами ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов.

Порядок проведения анализа микроРНК с использованием биочипов включает:

1. Выделение мРНК, включающей фракцию микроРНК из биологического материала.

2. Синтез кДНК (метод ОТ-ПЦР).

3. Мечение кДНК флуоресцентными зондами.

4. Проведение гибридизации. В основе гибридизационного анализа лежит использование комплементарного связывания нуклеотидов. Обнаружение специфической последовательности нуклеотидов кДНК осуществляется при помощи коротких олигонуклеотидных одноцепочечных фрагментов, имеющих репортерную группу на 5’-конце (микрозондов).

5. Очистка продуктов гибридизации от несвязавшихся биологических молекул.

6. Обработка результатов анализа. Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью флуоресцентного анализатора и соответствующей компьютерной программы. Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы (опухолевая ткань) сравнивают с гибридизационной картиной для контроля (нормальная ткань). Если специфическое окрашивание биологического микрочипа в местах, содержащих иммобилизационные олигонуклеотиды, сильнее от анализируемой пробы, чем от контроля, это свидетельствует о более высоком уровне экспрессии микроРНК в анализируемой пробе по сравнению с контролем и соответственно наоборот (принцип конкурентной гибридизации).

Метод ДНК-микрочипов находит в настоящее время широкое применение в практике. Он отличается высокой чувствительностью, простотой процедуры выполнения, возможностью одновременного анализа множества нуклеотидных последовательностей, специфичностью и воспроизводимостью. В тоже время метод имеет ряд недостатков, среди которых – присутствие в мРНК разных генов гомологичных нуклеотидных последовательностей. В этом случае с одной и той же пробой ДНК на ДНК-матрице может происходить гибридизация кДНК мРНК разных генов [9].

Заключение

Несмотря на многие годы напряженной работы по определению биомаркеров злокачественных  новообразований, ни один из них не вызывал такого интереса как микроРНК.

Открытие микроРНК и перспектив их использования дает новые возможности регулирования экспрессии генов. Характерный профиль генной экспрессии при различных типах опухоли и ее прогностическая ценность предполагают, что микроРНК занимает уверенную позицию в диагностике и прогнозе развития заболевания.

Многочисленные  исследования показали, что микроРНК могут классифицировать злокачественные  новообразования и предсказать  результаты терапии с высокой  точностью.

Также, более  глубокое понимание роли микроРНК в  устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам позволит разработать новые методы, использующие микроРНК в качестве основных мишеней в преодолении устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованных источников

1 Osada H., Takahashi T. MicroRNAs in biological processes and carcinogenesis // Carcinogenesis. – 2007. – № 28. – P. 1-2.

2 Lee Y. The nuclear RNase III Drosha initiates miRNA processing // Nature. – 2003. – № 425. – P. 415-419.

3 Русин И. МикроРНК и явление РНК-интерференции. РНК-интерференция: микро-РНК как новые регуляторы работы генов и перспективные терапевтические мишени [Электрон. ресурс] – 17 мая 2009. – Режим доступа: http://knol.google.com/k/.

4 Garzon R. MicroRNA expression and function in cancer // Trends Mol. Med. – 2006. – Vol. 12, № 12. – P.580-587.

5 William C.S. Cho MicroRNAs in Cancer Translational Research. – New-York: Springer, 2011. – 511 с.

6 Zhang B. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors // Dev. Biol. – 2006. – № 23. – P. 134-139.

7 Tongsen Zheng, Jiabei Wang, Xi Chen, Lianxin Liu Role of microRNA in anticancer drug resistance // International Journal of Cancer – 2010. – № 126. – P. 2-10.

8 Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев  Е.Г. Рюмин Д.В. Новейшие технологии  в генодиагностике: полимеразная  цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) [Электрон. ресурс] – Режим доступа: http://pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm.

9 Гибридизационный  анализ ДНК с использованием  биологических микрочипов [Электрон. ресурс] – Режим доступа: http://1doklad.ru/index.php?option=com_ content&view=article&id=350%3A2011-05-11-12-22-29&catid=9%3A2010-06-30-10-37-48&Itemid=11&showall=1http://dna.pynny.ru/russian/main.html.