МикроРНК в диагностике и прогнозе развития злокачественных новообразований

Введение

Несмотря на существенные достижения современной медицины в диагностике ряда патологий, проблемы раннего выявления онкологических заболеваний, продолжают волновать медицинскую общественность. Сегодня описан большой класс малых РНК, названный микроРНК, который может обеспечить прорыв в этой области.

МикроРНК представляют собой класс некодирующих белок молекул РНК, длинной 21-25 нуклеотидов, основной функцией которых является регуляция активности генов на посттрансляционном уровне. Впервые микроРНК была охарактеризовано исследовательской группой под руководством В. Амброса в 1993 г. Начало этому было положено установлением мутации у нематод Caenorhabditis elegance, которая приводила к нарушению превращения куколки во взрослое животное. После более чем 10-летнего исследования белка, ответственного за развитие этого феномена, была обнаружена малая некодирующая белок РНК, названная lin-4, которая необходима для развития фенотипа данной мутации. Дальнейшие исследования показали, что lin-4 отрицательно контролирует экспрессию гена lin-14 путем присоединения к 3’-нетранслируемой области lin-14 тРНК через несмысловое взаимодействие РНК-РНК. Тем не менее, функции микроРНК оставались неизвестными до открытия другой микроРНК let-7, выявленной у множества организмов. С тех пор исследование микроРНК стало одной из наиболее актуальных тем в биологии и медицине.

В настоящее  время установлено, что микроРНК регулируют экспрессию более чем 30% генов, кодирующих структуру белков [1] и играют важную роль во многочисленных метаболических и биологических процессах. Предполагается, что именно микроРНК могут служить новыми биомаркерами в диагностике онкологических заболеваний и обеспечить новую стратегию генной терапии с использованием технологий микроРНК.

 

Основная  часть

1 МикроРНК: биогенез и механизм регуляции экспрессии генов

1.1 Биогенез микроРНК

В настоящее  время установлено существование  трех источников транскрипции микроРНК в клетке:

• гены микроРНК (61%), расположенные в интронах белок-кодирующих генов;
• гены микроРНК, расположенные в интронах белок-некодирующих генов;
• гены микроРНК, расположенные в экзонах белок-некодирующих генов.

Биогенез микроРНК является многоступенчатым процессом, в котором участвует множество ферментов.

Транскрипция  микроРНК осуществляется в ядре с помощью РНК-полимеразы II/III, в результате чего образуются первичные микроРНК – при-микроРНК. Длина первичных транскриптов колеблется от нескольких десятков до более тысячи нуклеотидов. Процесс созревания микроРНК управляется серией ферментов-рибонуклеаз из семейства РНКаз III. Первым из этого семейства у человека был выделен фермент Drosha – ферментный комплекс, ключевым в этом комплексе является белок Pasha, который и связывает двухцепочечную РНК. Функция Drosha ― из первичного транскрипта (при-микроРНК) вырезать двухцепочечную пре-микроРНК длиной 70 нуклеотидов, имеющую структуру петли. Затем пре-микроРНК транспортируются в цитоплазму при помощи белка клеточного транспортера Exportin 5, где процессируются в зрелые микроРНК благодаря взаимодействию с эндонуклеазой Dicer, являющуюся активатором образования мультиферментного комплекса RISC. Фермент Dicer разрезает молекулы двуцепочечной пре-микроРНК на короткие фрагменты, длиной порядка 20-25 нуклеотидов, одновременно нанося две засечки в 2 нуклеотида с каждой 3’-стороны, в результате чего образуются дуплексы микроРНК:микроРНК. Длина микроРНК строго детерминирована – от 19 до 31 нуклеотида. Молекулы с меньшей длиной теряют специфичность, если же образуется микроРНК с длиной более 31 нуклеотида, в клетке начинает синтезироваться интерферон и включается система защиты. Одна из двух цепей каждого получившегося фрагмента называется ведущей. Эта цепочка встраивается в комплекс RISC. Вторая цепочка микроРНК используется как субстрат для обеспечения энергией. Активированный RISC, соединяется с комплементарной последовательностью мРНК. Результатом связывания может быть частичная или полная приостановка трансляции белка с мРНК, либо же полный распад мРНК при участии РНКаз цитоплазмы [2].

1.2 Регуляция  экспрессии генов посредством  микроРНК

В настоящее  время установлено, что микроРНК регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих белки, посредством 3 механизмов:

• репрессия трансляции мРНК;
• прямая деградация мРНК;
• микроРНК-опосредованное разрушение мРНК.

В каждой микроРНК есть участок, комплементарный особому участку в той мРНК, которая подлежит инактивации. Таким образом, большинство мРНК имеют «черные метки», указывающие на возможность собственной деградации, а микроРНК выступают в качестве адаптеров, использующих комплекс RISC для атаки мРНК посредством комплементарного спаривания в 3’-нетранслируемой области [2]. Первично микроРНК взаимодействуют посредством 6-8 нуклеотидов на своем 5’-конце с мРНК-мишенью. Эта область микроРНК, являющаяся одним из факторов, детерминирующих распознавание мишени, получила название «seed»-области и является высоко консервативной для одного семейства микроРНК у разных видов.

Выбор механизма регуляции зависит от степени комплементарности микроРНК к мРНК-мишени. В настоящее время установлено, что при полной комплементарности запускается процесс распада мРНК РНКазами цитоплазмы. В большинстве случаев микроРНК связываются с неполной коплементарностью с мРНК-мишенью и осуществляют репрессию трансляции мРНК [3].

Кроме того, показано, что микроРНК воздействуют на экспрессию генов путем направленного разрушения мРНК с помощью деаденилирования РНК-мишеней. Известно, что 3’-поли(А)хвосты и 5’-головки очень важны для обеспечения стабильности мРНК и препятствуют разрушению последних. После того как микроРНК приводит к удалению 3’-поли(А)хвоста и 5’-головки у мРНК-мишени, наступает быстрое разрушение такой мРНК клеточными ферментами.

Другой тип  воздействия микроРНК заключается в способности подавлять транскрипцию генов, содержащих гомологичные микроРНК последовательности. Это явление было названо транскрипционным сайленсингом генов (TGS) и обнаружено у дрожжей, растений и животных. При этом микроРНК направляют модификации гистонов и метилирование ДНК, что приводит к образованию гетерохроматина и репрессии транскрипции. Наиболее полно TGS изучен у дрожжей S. Pombe. Установлено, что у них микроРНК встраиваются в похожий на RISC белковый комплекс, названный RITS и направляют его к гену, содержащему гомологичный микроРНК фрагмент. После этого белки RITS ингибируют метилтрансферазы, в результате чего в локусе, кодирующем ген-мишень микроРНК, формируется гетерохроматин, и активная экспрессия гена прекращается [1, 4].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Роль микроРНК в злокачественной трансформации

В настоящее  время роль микроРНК в развитии злокачественных  новообразований является наиболее изучаемым предметом. Установлено, что более 50% генов, кодирующих микроРНК человека, локализованы в областях хромосом, которые наиболее подвержены перестройкам, встречающимся в опухолевых клетках. Впервые участие микроРНК в развитии онкологических заболеваний показано для микроРНК miR-15 и miR-16, расположенных в хромосомной области 13q14. Репрессия этих генов наблюдалась у 68% пациентов с хронической В-лимфоцитарной лейкемией [3]. Последующие исследования показали, что в большинстве случаев злокачественные новообразования имеют альтернативный профиль экспрессии микроРНК по сравнению с соответствующими нормальными тканями и для каждого типа рака аберрантно экспрессируются как минимум две микроРНК. Установлено, что изменения в синтезе микроРНК связаны с возникновением, прогрессированием и метастазированием злокачественных новообразований.

Существуют различные механизмы нарушения экспрессии генов микроРНК при опухолевых процессах [5]:

1. генетические  изменения (генные мутации, хромосомные аберрации);

2. эпигенетические  изменения (метилирование);

3. дефекты в  посттранскрипционной регуляции (функциональные дефекты фермента Drosha и Dicer, нарушение экспрессии факторов транскрипции (Myc, Twist, p53);

4. ненормальная  реакция на различные стимулы  (дифференциации, пролиферации, гипоксии  и другие стресс стимулы).

Установлено, что  микроРНК могут быть как причиной, так и эффектом канцерогенеза. Как известно, при злокачественных заболеваниях возможно либо повышение, либо снижение экспрессии микроРНК, при этом они могут выступать в качестве онкогенов, посредством негативной регуляции генов – супрессоров опухоли (miR-21, miR-10a, и miR-155); либо генов-супрессоров опухоли (let-7, miR-125b, miR-34a и miR-145); эффект зависит от мишени (таблица 1) [6]. С другой стороны, микроРНК сами могут являться мишенями онкогенов (с-Myc) или генов-супрсессоров опухоли (p53).

Таблица 1 – Нарушение экспрессии микроРНК при некоторых злокачественных новообразованиях

Тип опухоли	Повышение экспрессии	Снижение  экспрессии
Рак молочной железы	miR-21, miR-29b-2	miR-125b, miR-145 miR-10b, miR-155, miR-17-5p
Глиобластома	miR-221, miR-21	miR-181a, miR-181b
Лимфома	miR-155, miR-17-92cluster	miR-15a
Рак толстой  кишки	miR-10a, miR-20a	miR-143, miR-145, let-7
Рак поджелудочной  железы	miR-221, miR-376a, miR301, miR-21, miR-24-2,	miR-375
Рак простаты	let-7d, miR-195, miR-203	miR-128a
Рак желудка	miR-223, miR-21	miR-218-2

Диагностически  информативным является то, что различные  типы рака имеют разный профиль экспрессии микроРНК. Более того, в процессе развития опухоли меняется и профиль  экспрессии микроРНК. Нарушение регуляции синтеза микроРНК которое, в свою очередь, является регулятором синтеза белков, могут быть если не первопричиной онкогенеза, то, по крайней мере, одной из главных причин. Предполагают, что микроРНК могут служить новыми биомаркерами в диагностике заболеваний и обеспечить новую стратегию генной терапии с использованием технологий микроРНК. Однако применение микроРНК перспективно не только для диагностики. Предполагается, что введение в раковые клетки синтетических или природных РНК, предназначенных для избирательного подавления патологическиповышенных уровней микроРНК – весьма перспективный метод молекулярной терапии злокачественных новообразований [5].

3 МикроРНК и химиоустойчивость

На сегодняшний день злокачественные новообразования остаются одной из наиболее важных проблем клинической медицины. Одним из главных методов лечения рака является химиотерапия. Устойчивость раковых клеток к химиопрепаратам продолжает быть главным клиническим препятствием успешного излечения. Причины резистентности опухолевых клеток к лечению, как в настоящее время полагают, связаны со случайно вызванными препаратами мутационными событиями (генетическая гипотеза), немутационным изменениям функции гена (эпигенетическая гипотеза), и изменением в кариотипе. К сожалению, ключевые детерминанты этого явления остаются в значительной степени неизвестными.

В настоящее  время, обширные исследования показали существование и важность механизма немутационного регулирования функции гена, осуществляемую микроРНК, а также ее роль в определении чувствительности и устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам. Установлено, что отклоняющаяся от нормы экспрессия микроРНК вовлечена в формирование фенотипа химиоустойчивости опухоли.

Как известно, одной из наиболее частых причин химиоустойчивости опухоли является активация MDRI (ABCBI) гена, которая приводит к сверхэкспрессии трансмембранного P-гликопротеина (P-gp). P-gp принадлежит к ATP-связывающей группе суперсемейства гликопротеинов (ABC) и функционирует как мембранный транспортер. Сверхэкспрессия P-gp приводит к развитию устойчивости злокачественных новообразований к широкому диапазону структурно и функционально разнообразных химиотерапевтических препаратов. Роль микроРНК в регулировании ATP-связывающих генов также привлекает особое внимание. Установлено, что повышенная экспрессия miR-27a и miR-451 вызывает сверхэкспрессию P-gp в линиях раковых клеток множественной лекарственной устойчивости A2780DX5 и KBVI по сравнению с их родительскими линиями A2780 и KB-3-1. Воздействие на клетки A2780DX5 антагонистов miR-27a или miR-451 снижает экспрессию P-gp и повышает их чувствительность к цитостатическим препаратам.

Другим представителем суперсемейства ABC является мембранный транспортер ABCG2, который также может играть существенную роль в развитии химиоустойчивости. Однако, немного известно о механизмах, лежащих в основе этого явления. Показано, что снижение экспрессии miR-519c в линии раковой клетки толстой кишки S1 приводила к сверхэкспрессии ABCG2 и развитию химиоустойчивости. Другой микроРНК, которая отрицательно регулирует экспрессию ABCG2, является miR-328. Предполагается, что сниженная экспрессия miR-328 может быть другим механизмом, приводящим к ABCG2-повышенной экспрессии в устойчивой к химиопрепаратам линии раковых клеток молочной железы (MCF-7/MXlOO). Полученные данные также указывают, что ABCG2-опосредованная устойчивость может быть изменена через регуляцию экспрессии соответствующих микроРНК. Многочисленными исследованиями выявлено, что повышение экспрессии mir-221/222 в эстроген- и Her2/neu-позитивных опухолях молочной железы приводит к развитию устойчивости опухоли к гормонотерапии за счет ингибирования экспрессии гена регулятора клеточного цикла p27^Kip1.

В результате многочисленных исследований установлена взаимосвязь  между микроРНК и ферментами, участвующими в метаболизме лекарственных препаратов. Показано, что экспрессия miR-27b в опухолевой ткани молочной железы ниже по сравнению с соответствующей нормальной тканью. Этот профиль экспрессии обратно коррелировал с экспрессией CYP1B1 члена семейства Cytochrome P450. Исследования in vitro установили вовлеченность miR-27b в пост-транскрипционную регуляцию CYP1B1 [7].

Таким образом, результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что нарушение  экспрессии микроРНК может играть важную роль в чувствительности и устойчивости опухолевых клеток к химиопрепаратам, а также о возможности вмешательства в механизмы развития химиоустойчивости путем моделирования уровня экспрессии микроРНК.

 

4 Методы исследования микроРНК

4.1 Метод  ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени —метод, основанный на одновременной амплификации и измерении количества анализируемой молекулы ДНК.

Метод использует общие принципы ПЦР, принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации (специфических ДНК/РНК-мишеней) непосредственно во время проведения реакции после каждого цикла амплификации (рисунок 1). Поскольку кинетика накопления ампликонов напрямую коррелирует с числом копий исследуемой матрицы, возможна относительная и абсолютная количественная оценка ДНК или РНК в образце.

Рисунок 1 –  Кривая накопления флуоресценции в ПЦР в реальном времени: зависимость интенсивности флуоресценции от номера цикла