Методы цитологии

Государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Северный (Арктический) Федеральный Университет имени М.В. Ломоносова»

Институт естественных наук и биомедицины.

 

 

 

 

Реферат по курсу Морфология и физиология клетки

на тему

«Методы цитологии»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила:

 

                            Проверила: 

                           

 

          

 

 

 

 

Архангельск 2014

 

Оглавление.

 

Методы цитологии:

1)Световая микроскопия

Прижизненное изучение клеток:

- метод клеточных культур

- метод микрохирургии

- метод флуоресцентной микроскопии

- метод  сканирующей и световой микроскопии

 

Изучение фиксированных клеток:

цитохимические методы:

-метод цитофотометрии

- метод иммунофлуоресценции

-метод радиоавтографии

-метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот

 

2)Электронная  микроскопия

-метод контрастирования биологических  объектов

-метод ультратонких срезов

-метод замораживания-скалывания

-метод сканирующей и электронной  микроскопии

 

3)Биохимические  методы

-фракционирование клеток

-получение клеточных фракций

                                    -создание безклеточных систем

-методы клеточной инженерии

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Световая микроскопия.

1. Прижизненное изучение клеток.

 

Метод клеточных культур.

Метод клеточных культур заключается в выращивании клеток или целых организмов из отдельных клеток с помощью питательных веществ и в условиях полной стерильности. Этот метод дает нам возможность изучать клетки разных органов, тканей растений и животных, а также, деление клетки, их дифференциации и специализации.

 

Метод микрохирургии.

Метод микрохирургии применяется для исследования живых клеток, для выяснения функций отдельных органов. Это метод оперативного вмешательства и воздействия на клетку, в т.ч. удаление или вживление  отдельных органелл. Этот метод также предусматривает пересадку органелл из клетки в клетку, введение крупных макромолекул в клетку. 

 

Метод флуоресцентной микроскопии.

Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки — это хлоропласты. Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. В живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию тех или иных химических веществ.

 

Метод сканирующей световой микроскопии.

Обычные методы световой микроскопии   трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за   небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и

изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной

программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта.

Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.

 

 

 

 

 

2. Изучение фиксированных клеток:

 

Цитохимические методы:

Метод цитофотометрии.

Метод, позволяющий определять химический состав клеток в гистологическом препарате по поглощению света клетками. Через препарат пропускают монохроматическое излучение (свет) в виде пучка, диаметр которого соизмерим с диаметром клетки или внутриклеточной структуры. Концентрацию исследуемого вещества в клетке находят по Бугера — Ламберта — Вера закону. Найдя концентрацию вещества внутри клетки и измерив её объём, можно рассчитать общее количество этого вещества в клетке. Ультрафиолетовая Ц. позволяет определять в неокрашенных препаратах количество нуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков по естественному поглощению ими УФ-лучей. Шире распространена Ц. в видимой области спектра. С помощью большинства красителей выявляют в клетке нуклеиновые кислоты, белки и их отдельные реактивные группы, а также определяют активность ряда ферментов.

 

Метод иммунофлуоресценции.

Реакция иммунофлуоресценции применяется для экспресс-диагностики многих заболеваний. Сущность метода: мазки-отпечатки головного мозга обрабатываются флюоресцирующим глобулином, содержащим связанные с люминесцентной краской антитела к вирусу. Если головной мозг поражен вирусом, то антитела связываются с антигеном вируса и образовавшийся комплекс антиген-антитело-люминесцентная краска имеет специфическое свечение.

 

Метод радиоавтографии.

Это самый  современный метод, возникший после стремительного развития ядерной физики, в результате которого мы смогли выделить радиоактивные изотопы разных элементов.  
Для этого метода нужны изотопы тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного метаболизма.   Поскольку радиоактивный изотоп участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог, и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. 
Один из способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и оказывает на пленку такое же действие, как свет.

 

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

Метод радиоавтографии используется также для определения расположения

определенных   типов   нуклеиновых   кислот   или   отдельных   нуклеотидных

последовательностей   в   составе   клеточных   ядер   или   хромосом   –  метод

молекулярной   гибридизации.   Для   этого   раствор   с   меченной   нуклеиновой

кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с

сателитной   ДНК)   наносят   на   препарат,   предварительно   обработанный   так,

чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в

составе   хромосом   или   ядер,   что   достигается   щелочной   или   температурной

обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование

молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и

комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации

определяется   радиоавтографически.   Этот   метод   молекулярной   гибридизации

нуклеиновых   кислот   позволяет   с   большой   точностью   локализовать   на

44 хромосоме   места   с   данной   нуклеотидной   последовательностью   или   даже

расположение определенных генов.

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также

при   окраске   их   флуорохромами.   Например,   если   выделенную   ядрышковую

ДНК, ответственную за  синтез рибосомных  РНК, предварительно связать  с

каким-либо   флуорохромом,   то   после   проведения   ренатурации   ДНК   на

препаратах с этой флуоресциирующей  рибосомной ДНК, можно видеть, что

флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или

только   в   зонах   ядрышковых   организаторов   митотических   хромосом.   Таким

образом можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже

расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод

(флуоресцентная in situ гибридизация).

 

2. Электронная микроскопия.

 

Метод контрастирования биологических объектов.

Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Этот метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран. При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем нанести их на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне. Преимущества метода в том, что растворенные соли могут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот

 

Ультрамикротомия.

Этот   метод   позволяет   применять   цитохимические   приемы   на   уровне

электронной   микроскопии:   в   данном   случае   необходимо,   чтобы   продукты

реакции   были   электронноплотными,   отклоняли   бы   электроны.   Кроме   того,

реакции   не   должны   приводить   к   появлению   артефактных   картин   уже   на

ультраструктурном   уровне.   Число   цитохимических   методов   в   электронной

микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.

В   электронно-микроскопических   исследованиях   оказалось   возможным

применить   методы   радиоавтографии.   В   этом   случае   используются

сверхтонкозернистые   эмульсии   (величина   гранул   около   0,02-0,06   мкм).

Недостатком   этого   метода   является   очень   большое   время   экспозиции,   в

некоторых случаях достигающие нескольких месяцев.

Все   большее   применение   получают   методы   приготовления   ультратонких

срезов   без   фиксации   и   заливки   клеток   в   твердые   пластмассы.   Это   методы

криоультрамикротомии,   т.е.   получение   срезов   с   замороженных   тканей,

моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196оС). При этом

происходит   практически   одномоментное   торможение   всех   метаболических

процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую,

ее   молекулярная   структура   беспорядочна   (стекловидное   состояние).   Такие

твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие

срезы   (нож   при   этом   также   охлажден).   Полученные   срезы   используют   для

выявления   в   них   активности   ферментов,   для   проведения   на   них

иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.

Для   проведения   иммунохимических   исследований   используют   антитела,

связанные   с   частицами   коллоидного   золота,   локализация   которого     на

препаратах и указывает на места расположения искомого антигена.

Изучение   срезов,   полученных   на   криоультратомах,   показало,   что   общая

структура   и   композиция   клеточных   компонентов   в   данном   случае   мало

отличаются  от того, что видно при использовании  химической фиксации и

обычных   приемов   получения   ультратонких   срезов.   Следовательно,   те

структуры,   которые   имеют   одинаковую   композицию   при   разных   методах

обработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению,

не являются артефактными.

В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иных

приемов электронной микроскопии.

 

Метод замораживания-скалывания.

С помощью этого метода исследуются тончайшие детали строения клетки, при этом получается объемное изображение в трансмиссионном электронном микроскопе. Клетки замораживают очень быстро при температуре жидкого азота (- 196¦ С). При таком мгновенном замораживании кристаллы льда не успевают образоваться, и клетка не испытывает деформаций. Замороженный блок раскалывают лезвием ножа. Затем избыток льда удаляют возгонкой. После  более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов. В трансмиссионном микроскопе электронный луч способен проникнуть только через очень тонкие срезы. Обычная толщина оттененных образцов чрезмерно велика, поэтому органическую материю, подстилающую слой металла, необходимо растворить. В результате остается тонкая металлическая реплика с поверхности образца. Реплику и используют в трансмиссионном микроскопе. Этот метод предоставил, например, уникальную возможность наблюдать внутреннее строение мембран клетки.

Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии.

Позволяет изучать трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов пробегает по поверхности объекта, и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности. С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта. Для получения такой информации объекты не следует покрывать слоем металла. Объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.

 

3. Биохимические методы

 

Фракцирование.

Помогает выделять органеллы из отдельных клеток. Этот метод широко используется и имеет самые важные и главные результаты. 
Он помогает определять химический состав органелл и 
ферменты, которые в них находятся. Результаты этого метода позволяют понимать суть и значение их функций в клетке. 
Сначала клетки доводят до разрушения с помощью гомогенизации и в определенной среде. Эта середа гарантирует сохранность органелл и препятствует их агрегации. Мембранные переплетения, ЭПР и плазматическая мембрана распадаются на фрагменты и позволяют тщательно изучать их строение и функции.