Локусы количественных признаков

Хорошей иллюстрацией достоинств IBD-метода является работа Hugot и др. (1996) - один из первых примеров применения мультилокусного ASP-анализа сложнонаследуемого признака для сканирования всего генома. Им удалось картировать один из генов болезни Крона (регионального энтерита, MIM 266600) на хромосоме 16 между маркерами D16S409 и D16S419. Авторы использовали две независимые панели семей (всего 78 сибсовых пар) и 270 высокополиморфных маркеров, распределенных по всему геному. Первоначальный параметрический анализ сцепления не позволил картировать ген. Максимальный лод-балл (2.04 для локуса D16S409) был значительно ниже, чем предсказанный на основе аутосомно-рецессивной модели. ASP-анализ на этом же наборе родословных и маркеров позволил картировать предполагаемый ген болезни Крона на хромосоме 16 на уровне значимости р<0.01 для обоих независимых панелей семей, несмотря на относительно небольшое увеличение относительного риска, связанное с этим локусом.

Рис.5. 16ая хромосома человека

Интервал, в котором картирован ген болезни Крона, имеет размер около 4 Мб - он слишком велик для  эффективного физического картирования. Современные технологии клонирования позволяют идентифицировать ген, если район его предполагаемой локализации ограничен 1 сМ, что приблизительно соответствует 1 Мб. Какова же "разрешающая способность" метода общих аллелей? Оценили мощность IBD-метода для высокоразрешающего позиционного клонирования, сопоставив долю IBD-аллелей с уровнем относительного риска. Признак с очень высокой долей общих аллелей (ZL) в сибсовых парах соответствует простому менделевскому (например, при Zu=0.975, ха =40). Для картирования признака с ZL=0.975 с уровнем разрешения в 1 сМ с 95% вероятностью достаточно 170 мейозов (43 сибсовых пары). Картирование признаков с xs от 6 до 40 с таким же разрешением потребует примерно вдвое большую выборку семей. При дальнейшем уменьшении относительного риска и, следовательно, доли общих аллелей, требования к размеру выборки резко возрастают.

3.3. Ассоциации в популяциях и семьях

Исследования ассоциаций, в отличие  от двух предыдущих методов генетического  картирования, основаны не на анализе косегрегации генетического материала в семьях, а на поиске популяционных корреляций в частотах аллелей. В классическом случае они представляют собой сравнение больных индивидов со здоровыми из той же популяции. Генетический маркер (аллель данного гена) считается ассоциированным с болезнью, если его частота среди больных значимо выше, чем в контрольной выборке.

Исторически исследования ассоциаций сыграли решающую роль в выявлении генетической компоненты аутоиммунных и сердечно-сосудистых заболеваний. Анализ популяционных ассоциаций показал вовлеченность комплекса HLA в этиологию таких связанных с иммунными нарушениями состояний как диабет типа 1, множественный склероз, ревматоидный артрит, системная волчанка и позволил выявить роль наследственной вариабельности генов метаболизма липидов (аполипоротеина В, рецептора липопротеинов низкой плотности, кластера генов аполипопротинов А1-СЗ-А4 и др.) в этиопатогенезе атеросклероза и нарушений липидного обмена. Степанов и др. Из недавних примеров ассоциаций можно назвать исследования, показавшие ключевую роль гена АРОЕ в болезни Альцгеймера, и участие ангиотензин-конвертирующего фермента в этиопатогенезе инфаркта миокарда. Применительно к моногенным признакам ассоциации успешно использовались для дальнейшего уточнения локализации гена, первоначально обнаруженного методами анализа сцепления. Такой подход применялся при картировании муковисцидоза, хореи Гентинг- тона, болезни Вилсона и др.

В основе ассоциации генетического  маркера с болезнью могут лежать три причины. Во-первых, наличие ассоциации может свидетельствовать о том, что ассоциированный локус и  есть ген или один из генов болезни. В этом случае следует ожидать, что  положительная ассоциация будет  иметь место во всех популяциях. Во-вторых, причиной ассоциации может  быть неравновесие по сцеплению между  маркерным локусом и локусом  болезни. Это возможно в том случае, когда ассоциированный аллель находился на предковой хромосоме, а сам локус расположен достаточно близко к локусу болезни, чтобы эта корреляция не была нарушена рекомбинацией за время существования популяции. И, наконец, ассоциация может быть артефактом, возникшим вследствие подразделенности популяции.

Для целей генетического картирования важно отделить два первых случая от третьего. Этого можно добиться, исследуя ассоциации в гомогенных изолированных  популяциях, используя внутрисемейный контроль или проводя тест на неравновесие при передаче от гетерозиготных родителей к больным детям ассоциированный аллель должен передаваться чаще, чем неассоциированный.

Наиболее перспективны для идентификации  генов комплексных состояний исследования ассоциаций на семейном материале. При этом контрольную популяцию аллелей составляют аллели здоровых родителей, которые не передаются больным детям. Этот подход называется AFBAC-методом.В первой родословной родители имеют генотипы АВ и CD, а больной ребенок - генотип АС. Следовательно, аллели В и D, не передавшиеся потомку, составят контрольную популяцию. Для второй родословной в контрольную группу войдет аллель D. Если имеется большая выборка подобных родословных, можно сравнить частоты аллелей А, В, С и D у больных и в контрольной группе и выявить возможные ассоциации. Поскольку используются ядерные

семьи, родительские аллели, несцепленные с геном или генами болезни, будут всегда сегрегировать независимо от аллелей гена предрасположенности к болезни. Тем самым, устраняются эффекты, связанные с подразделенностью популяции, и выявляются ассоциации только для маркеров, физически сцепленных с локусом болезни.

АВ CD            АВ CD

О И-гО 

*АС      АС

Контроль: В, D Контроль: D

Рис.6. Поиск ассоциаций на семейном материале. AFBAC- метод: контрольную популяцию составляют маркерные аллели родителей, которые не передаются больным детям.

Исследования ассоциаций на ядерных  семьях позволили подтвердить роль гена инсулина при сахарном диабете  типа 1, для которого ранее были показаны ассоциации на популя- ционном уровне, и помогли выявить маркеры, сцепленные с полипозом толстой кишки. В принципе, AFBAC-метод вполне приемлем и для полного геномного скрининга, однако примеры таких исследований нам пока не известны.

Еще одной потенциально мощной стратегией генетического картирования является поиск ассоциаций в изолированных популяциях с небольшим числом основателей. Этот подход называется картированием с помощью неравновесия по сцеплению. Лежащая в его основе идея проста: чем более высокая степень генетической изоляции характерна для такой популяции, тем больше доля больных, унаследовавших ген болезни от общего предка, и, соответственно, тем больше вероятность, что причиной ассоциации является физическое сцепление маркера с геном болезни. Ассоциацию в изолированной популяции можно интерпретировать и с точки зрения метода общих аллелей. Все члены изолированной популяции являются, в определенной степени, дальними родственниками. Сравнивая частоту аллелей у больных и в контрольной группе, мы, тем самым, оцениваем долю общих аллелей у дальних родственников, используя не только мейозы в данном поколении, но и все мейозы в истории популяции. Сейчас в работах по картированию наиболее активно используется в качестве генетического изолята финская популяция. Стратегия картирования по неравновесию недавно была успешно применена для поиска гена диастрофической дисплазии (DTD) - моногеного менделевского заболевания. Традиционные методы анализа сцепления позволили локализовать ген DTD в районе размером 2 Мб, а затем анализ неравновесия по сцеплению в финской популяции сузил этот регион до 40 Кб, что позволило клонировать ген. Подобная технология применима и для сложнонаследуемых состояний, хотя доля больных, имеющих общего предка, в этом случае должна быть меньше.

3.4.Экспериментальные скрещивания модельных объектов

Экспериментальные скрещивания животных являются одним из важнейших методов генетического картирования. Возможность получить большое число потомков от одного скрещивания и использование чистых линий полностью устраняют проблему генетической гетерогенности. Экспериментальные манипуляции и скрещивания позволяют легко получить конгенные линии, т.е. линии, отличающиеся только по одному нужному участку генома в плоть до одного локуса. Крайне привлекательной для исследования мультифакториальных состояний является и возможность легко унифицировать условия окружающей среды. Все эти преимущества дают возможность исследовать на экспериментальных объектах гораздо более сложные генетические взаимодействия, чем это возможно на родословных человека. Особенно ярко это иллюстрируется на примерах разложения количественных признаков до генетических составляющих - у человека исследования такого рода пока невозможны. Сейчас, когда созданы подробные карты генетического сцепления мыши и крысы, стало возможным интервальное картирование локусов количественных признаков. Впервые картирование QTL на всем геноме было проведено при исследовании эпилепсии у мышей и гипертонии у крыс. В последнем случае эти работы послужили основанием для параллельных исследований у человека, которые выявили сцепление с гипертонией гена ангиотензин-конвертирующего фермента.

Главная проблема, связанная с генетическим картированием на экспериментальных объектах, возможность переноса этих результатов на человека. Существуют два пути - функциональный, т.е. исследование генетического контроля аналогичных метаболических путей, и позиционный - исследование участков генома человека, гомологичных соответствующим мышиным.

В настоящее время существуют экспериментальные  модели многих комплексных болезней человека - инсулин-зависимого  и независимого диабета, рака, гипертонии , атеросклероза, эпилепсии, множественного склероза, астмы, дефектов нервной трубки и таких поведенческих количественных признаков как предпочтение пищевых субстратов (алкоголя, морфина, кокаина).

3.5. Метод разложения  дисперсий.

Подход является новым, корни его  лежат в количественной генетике, где долгие годы основная задача сводилась  к оценке вклада генотипа в изменчивость признака и в оценку коэффициента наследуемости. Коэффициент наследуемости  определяется как доля генотипической дисперсии в общей дисперсии  признака. Для его оценки необходимо разложить дисперсию на компоненты, обусловленные генотипом и средовыми  воздействиями. Заполняется вариационно- ковариационная матрица, диагональные элементы которой соответствуют  общей дисперсии признака в популяции, а недиагональные элементы, описывающие  сходство между парой родственников, определены степенью их родства и  генотипической составляющей дисперсии.

Теперь, допустим, что у нас есть дополнительная информация о генотипах  маркерного локуса. Тогда можно проверить, не лежит ли один из QTL вблизи этого  маркера. Это делается следующим  образом. Генотипическая компонента дисперсии  раскладывается на две составляющие: одна обусловлена тестируемым локусом, а вторая - всеми остальными QTL. Для  первой составляющей коэффициент определяется по IBD маркерных аллелей, а второй - по степени родства. Анализ сцепления  в этом случае сводится к проверке значимости вклада генотипа предполагаемого  локуса в полиморфизм признака. Материалом для анализа как правило являются ядерные родословные.

3.6. Анализ ассоциаций.

Метод заключается в анализе  ассоциаций аллелей маркерного локуса и фенотипических характеристик  признака. В основе этого подхода  лежит предположение о том, что  аномальный фенотип вызван определенной мутацией какого-то гена, тесно сцепленного  и находящегося в неравновесии по сцеплению с изучаемым маркером. Тогда частота болезни среди  случайно выбранных из популяции  особей должна зависеть от генотипа маркера. Для редких болезней используют другое сравнение - частота определенного  аллеля у больных должна быть выше, чем у здоровых членов популяции. Как видно, этот подход, в отличие  от трех предыдущих не требует информации о родственниках, он может быть реализован на популяционных данных. Однако, из-за неоднородности популяций анализ ассоциаций может дать ложно положительный  ответ. Чтобы предотвратить это  было предложено использовать не популяционный, а родительский контроль, сравнивая  аллели переданные и не переданные больному потомку. Для проверки значимости различий был предложен очень  популярный в последнее время TDT критерий. Анализ ассоциаций позволяет  тестировать гены-кандидаты, а также  устанавливать тесное сцепление  предполагаемого гена с маркером. Из-за этого, а также из-за простоты использования на этот подход возлагаются  очень большие надежды.

3.7. Многоточечное картирование.

Первоначально для картирования генов  использовали отдельные маркеры, поочередно проводя двуточечный анализ. Развитие молекулярной генетики обеспечило создание огромного числа маркеров, что  позволило перейти от рассмотрения пары локусов, состоящей из маркера  и анализируемого гена, к позиционированию анализируемого локуса в каждую точку  генома. В результате такого анализа  строится кривая, описывающая правдоподобие  локализации анализируемого гена в  каждой точке генома. Локусы с высоким  значением LOD рассматриваются как  места локализации предполагаемого  гена. Многоточечное картирование имеет  ряд преимуществ перед двуточечным, основным из которых является повышение  информативности данных.

3.8. Кандидатные гены широко распространенных заболеваний

Была получена исследовательская парадигма генетической этиологии коронарного атеросклероза. Однако предложенная схема носит более универсальный характер и с некоторыми нюансами может быть основой для изучения этиологии любых МФЗ. Представим кратко комментарии к основным разделам данной схемы.

Локализация генов. Анализ генетического  сцепления и ассоциаций с использованием сотен маркеров, охватывающих весь геном, позволяет определить локализацию генов подверженности МФЗ. Для такого анализа используются два способа - подход "кандидатных генов" и "геномный поиск".

Идентификация генов. Локализованные до определенного региона гены могут  быть идентифицированы, используя знание о метаболизме и патофизиологии МФЗ, позиционным клонированием или комбинацией подхода кандидатных генов и позиционного клонирования (позиционно-кандидатный подход). Решение этой задачи определяется успехами в детализации геномных карт. Новым мощным средством для идентификации и характеристики генов, вносящих вклад в подверженность МФЗ, являются метки экспрессируемых последовательностей (EST).

Функциональные мутации. После обнаружения кандидатного гена необходим поиск вариаций кДНК в кандидатном регионе и выяснение их точной природы с помощью секвениро- вания ДНК. На этом этапе возникает задача дифференциации функциональных вариантов от нейтрального полиморфизма. Трудоемкость решения этой задачи может быть очевидна из примера - известно более 150 мутаций гена рецептора LDL.

Экспериментальные системы. Устоялось мнение о том, что модельные животные помогают проверить и уточнить эффекты отдельных генов сложных признаков и МФЗ независимо от других локусов и средовых факторов. Трансгенная технология дает возможность проверить эффекты изменения числа генного продукта, манипулируя числом копий генов. Развитие моделей МФЗ на животных позволяет тестировать функциональные варианты кандидатных генов.