Кріоглобуліни як патологічні антитіла: будова, методи визначення та діагностична цінність

  Пацієнти з типом 1 та 2 переважно мають симптоми, асоційовані з експозицією на холод, включаючи Raynauds-синдром (Рейно), судинну перпуру, тенденцію до збліднення. Індуковані холодом уртікарії, та навіть дистальні артеріальні тромбози з гангреною.

   Для пацієнтів  з 2-м типом характерні симптоми поліартриту, васкуліту, гломерулонефриту, неврологічні маніфестації, слабість, лімфаденопатія. Всі пацієнти з 2-м типом кріоглобулінемії повинні бути протестовані на гепатити В і С – більшість випадків асоційовані з цими хворобами. Можливе повторне розчинення (ресолюбілізація) кріокомплексів з наступним вивільненням інфекційного агенту. У складі кріокомплексів збудники є практично невразливими до засобів етіотропної терапії (противірусних, антибактерійних, протипротозойних середників). За рахунок зв’язування як самих інфекційних агентів, так і антитіл до них значно зменшується можливість їх виявлення – зростає ймовірність хибно негативних результатів в імуноферментних, меншою мірою – в ампліфікаційних реакціях. Але є випадки ессенціальної кріоглобулінемії, не асоційовані з інфекційними гепатитами та іншими причинами.

   Доведеним вважається факт більш повільного та доброякісного перебігу хронічних інфекційних хвороб на тлі кріоглобулінемічного синдрому 3-го типу. Встановлено, що ці білки можуть практично не зворотно зв’язувати збудників і виводити їх з місць реплікації.

   Вважають, що моноклонові кріоглобуліни найчастіше асоціюються з лімфоретикулярними хворобами, рідше – з лімфаденітом. Поява в сироватці крові моноклонових кріоглобулінів, особливо класу М, свідчить про процес перебудови генів важких ланцюгів імуноглобулінів та клональну експансію В-лімфоцитів.

   Першою основною причиною появою кріоглобулінів є перебудова генів. Цю перебудову генів ланцюгів імуноглобулінів можуть викликати:

• лімфотропні інфекції (70-85%)
• тривалий вплив малих доз радіації
• токсичні чинники.

  Другою причиною можна назвати хвороби нирок, печінки, шкіри (переважно з автоімунним компонентом). При системних хворобах сполучної тканини (колагенозах) ко-тригерну роль можуть відігравати авто антитіла, найчастіше – ревматоїдний фактор, який часто ідентифікують у складі кріопреципітатів.

  Третя причина – змінений синтез імуноглобулінів – може розвинутися внаслідок сильного і тривалого переохолодження (призводить до кріопреципітації навіть тих протеїнів, котрі залишаються розчинними при незначному зниженні температури тіла). Різке зневоднення організму ( зумовлює розвиток тимчасової гіперпротеїнемії і зниження розчинності білків). Вікове чи ятрогенне зниження ест радіолу в жінок знижує відштовхуючу функцію ендотелію судин.

   Характерно, що незначна кількість кріоглобулінів виявляється в крові здорових людей і не супроводжується патологічними клінічними проявами.

   Найчастіше  першими синдромами кріоглобулінемічного  синдрому є прояви підвищеної чутливості до холоду: холодова кропив’янка, синдром Рейно. Проте іноді хвороба дебютує серйозними ураженнями шкіри, нирок та печінки.

   Моноклональна кріоглобулінемія переважно асоційована з добре відомими гематологічними порушеннями і переважно є асимптоматична. Змішані кріоглобуліни часто виявляються при багатьох інфекціях та системних імунних хворобах.                                                                 (  2  )

2.2. ПРИНЦИП МЕТОДУ.

   Це є один простий метод,  котрий використовується для визначення кріоглобулінів – полягая у поміщенні сироватки при 4*С та огляді цієї сироватки через 2 чи 3 дні для визначення, чи є в ній видимий преципітат. Якщо преципітат є, використовуються різні методи для визначення типів імуноглобулінів і білків, котрі в ньому присутні.

   Деякі  з різноманітних методів електрофорезу  білка чи імунофіксації можуть бути вжиті для визначення присутності моноклональних імуноглобулінів. Додаткові методи для вивчення преципітату – це класичні оларозні преципітуючі методи, електрофорез Onchterlony чи кількісний електрофорез – для того, щоб показати присутність різних білків, для того ж, щоб визначити їх кількість, використовуються інші методи, наприклад нефелометрія. В багатьох випадках виявляють ревматоїдний фактор, IgG, IgA, IgM, C3, C4, та фібриноген. У багатьох кріоглобулінах виявляється також присутність альбуміну та фібропектину.

Рекомендований метод для визначення кріоглобулінів.

   Визначення кріоглобулінів є дуже простим тестом. Зразки крові поміщують в не – SST (сепаратор сироватки) пробірки і безпосередньо відразу поміщають у водяну баню при +37 *С на 30-60 хв. Після того швидко центрифугують і відбирають сироватку в окрему ємкість.

   Сироватку поміщають в  туби 12*75 мм. Має бути 2 туби з однаковим об’ємом сироватки. Одна залишається стояти при кімнатній температурі, інша – переноситься в холодильник при +4*С на період 48-72 години.

   Під кінець інкубацій  обидві туби візуально очищають  – чи відрізняється туба з  холодильника від тої, що стояла  при кімнатній температурі. Якщо в тубі з холодильника є кріопреципітат, його відцентрифуговують. Таким чином кріопреципітат готують до подальших досліджень.

   Визначення протеїнового  складу кріопреципітату 2 або 3 мл сироватки поміщають в скляну чи пластикову тубу 12*75 мм і охолоджують при +4*С 48-72 год. Преципітат відцентрифуговують в охолодженій центрифузі, 3-4 рази відливають сольовим розчином. Преципітат розчиняють 100-250 мл холодного сольового розчину і тубу поміщають в баню з +37*С для цього розчинення.

   Розчинені білки кріопреципітату досліджують трьома методами для визначення присутності чи відсутності імуноглобулінів, компонентів комплементу, та остаточного фібриногену. Для 1-го методу беруть 5 мл зразка та вносять у пластинку високо-розрішаючого електрофорезу, проводять стандартний білковий електрофорез (набори для білкового електрофорезу від BECKMAN Instruments, Brea, California or Helena, Beanmont, Texas). Після того, як на пластині виявимо білки, на електрофоретичній кривій визначаємо присутність простих моноклональних (зв’язків) фрагментів в області гамма. Якщо цих фрагментів буде декілька, рекомендуємо вжити електрофорез з імунофіксацією для визначення класу моноклонального протеїну, котрий присутній, а також тип легкого ланцюга. Для 2-го методу беруть 100 мл зразка і тестують нефелометричним методом для виявлення ревматоїдного фактору. Якщо немає такої можливості, можна використати латексний аглютинацій ний тест для визначення RF активності в кріоглобулінах. Третій метод – тест Оухтерлоні, модифікований таким чином. В центр пластинки вносять зразок кріопреципітату, а навколо розміщують 6 лунок (дорожок) для внесення анти сироваток – IgG, - IgA, - IgM, - C3, -C4, фібриноген.

   Після 72 год  інкубації агаровий гель вивчають  на рахунок виявлення ліній  преципітації, котрі свідчать про присутність якогось з білків. Якщо є якісь сумніви малі кількості зразка можна аналізувати як тотальний білок присутній в преципітаті. Кількість білка в мл/dl для тотального протеїну чи IU/ml для ревматоїдного фактору враховується по відношенню до виміряного рівня всіх складників кріоглобулінового преципітату- концентрату.

   На основі результатів  вище перелічених тестів визначаються  типи кріоглобулінів(I,II,III). Компоненти кріоглобулінів, присутні в кріоглобулінових комплексах, також визначаються.

    Стандартів і контролів для кріоглобулінів не існує. Позитивні контролі, тобто позитивні зразки, котрі використовують для визначення чутливості методу до низьких концентрацій кріоглобулінів, важко здобути. В деяких лабораторіях зразки, котрі містять кріоглобуліни, вибирають при плазмоферезі хворих з рідкісними випадками їх наявності,. Позитивні зразки заморожують і збирають. Зазвичай вони легко преципітують, але можуть не містити такої кількості преципітату, як оригінальний препарат.

    Негативні  контролі для кріоглобулінів  легко здобути. Їх також беруть  від пацієнтів у подібний спосіб. Не дивлячись ні на що, ця  практика є непотрібною. Альтернативним  методом контролю може бути метод парних проб. Звичайний порядок роботи – це використання позитивного і негативного контролів, якщо досліджуваний зразок виявляється позитивним. Якщо взяти людську популяцію як 100%, позитивний результат кріоглобулінів може бути менше ніж у 5%. Негативний контроль – береться нормальна сироватка в об’ємі 2-3мл., заморожена до -20*С. Щоб отримати негативний контроль, пацієнта сироватку в пробірці інкубують при кімнатній температурі, що використовується для попередження фальшивого виявлення преципітатів фібрину та фібриногену як кріоглобулінів. Преципітати фібриногену можна бачити в пробірці, якщо забирати тромб від крові раніше часу, потрібного для відділення сироватки. Також це можна бачити у хворих з порушеннями коагуляції, чи у пацієнтів котрі приймають антикоагулянтну терапію.

    Доброю практикою  є реєстрація із позитивними  кріоглобулінами в базі даних.  Часом позитивний результат знаходиться  у пацієнта, і вдається виявити  тип кріоглобулінів, в такому  випадку всі наступні зразки від цього пацієнта будуть цього ж типу. Рідкісним винятком може бути перетворення пацієнта з гепатитом С – інфекцією з типом 3 кріоглобулінемії в тип 2, якщо цей пацієнт почне продукувати високий рівень моноклонального Ig M (ревматоїдного фактора).

   Лабораторні методи, які використовуються для виявлення кріоглобулінів, дуже різні. Сироватку крові залишають протягом 4-7 днів при температурі від 0 до +4. Випадання осаду чи наявність інших включень свідчить про наявність кріоглобулінів у сироватці.

   Для ідентифікації типу кріоглобулінів використовують метод гістерезисних кривих. Визначають оптичну щільність розчину сироватки крові у веронал-мединаловому буфері при рН 8,6 і при температурі +37 (Д1) та після охолодження розчину до +4 протягом 24 год. (Д2). Після цього повторно визначають оптичну щільність розчину сироватки після інкубації у термостаті при +37 протягом 1 год. (Д3) і наступного охолодження до +4 протягом 24 год. (Д4). При кріопатії 1-го типу спостерігають збіг показників Д1 і Д4 (різниця в обох випадках менша 10%).

   При кріопатії 2-го типу  спостерігають збіг показників  Д1 і Д3 (різниця менша 10%) і  розходження показників Д2 і  Д4 (різниця більша 10%). При кріопатії  3-го типу спостерігають розходження  показників Д1 і Д3, а також  Д2 і Д4 (різниця в обидвох випадках більша 10%).

   Диференціювання типів кріоглобулінемії  має суттєве значення для подальшого  діагностичного пошуку, зокрема,  встановлення етіологічного чинника,  котрий міг спровокувати формування  синдрому, та вибору адекватної  терапії.

                                                                                                                        ( 17 )

   2.3. На протязі терапевтичного лікування хворих з 1-м типом кріоглобулінів (хіміотерапія, спрямована проти В-клітинної проліферації) чи хворих з 2-м типом кріоглобулінів (інтерферон, спрямований проти вірусу гепатиту С), рівень кріоглобулінів може зменшуватися або зникати. Множинний моніторинг рівня кріоглобулінів використовується для на протязі лікування інтерфероном пацієнтів з типом 2 кріоглобулінів. Моніторинг рівня кріоглобулінів може бути невдалим стосовно типу 1 кріоглобулінів, більш відповідним способом визначити відповідь на хіміотерапію є нефелометричне вимірювання рівнів IgG, IgA чи IgM, залежно від моноклонального типу, коли зразок кріоглобуліну є виміряний на нефелометрі, рекомендується потримати його в теплі для забезпечення повного розчинення імуноглобулінів.

   Так, рутинний моніторинг результатів від кріоглобулінів 1 і 2 типів може бути використаний для виявлення якості активності, яка корелює з терапією, яку приймають пацієнти.

Вивчення 3-го типу кріоглобулінів застосовується менше, однак, певна кількість від пацієнтів із 3-м типом кріоглобулінів була проаналізована і дала подібні результати. База даних, котра містить список пацієнтів, позитивних по 1-му типу кріоглобулінів, може використовуватися для контролю якості роботи хімічних та гематологічних лабораторій – кріоглобуліни мають співвідноситися з іншими методами обстежень цих пацієнтів.

   Оскільки важко  отримати добрий позитивний контроль для виявлення кріоглобулінів, виявлення позитивний кріоглобулінів контролюється рутинними способами. Наприклад, електрофорез нормальної сироватки для електрофорезу білків – кріопреципітатів, та тести імунофіксації. Для ревматоїдного фактору використовуються негативно, низько-позитивні та високо-позитивні контролі з рутинних наборів реактивів. Для імуноелектрофорезу по Ouchterlony використовується нормальна сироватка, розведена в багато разів, як позитивний контроль, якщо до неї є відповідна анти сироватка.

Кількісний контроль вимірювання  кріоглобулінів.

   Важливо є відзначити  технології для вимірювання кріоглобулінів, якщо вони є позитивними. Якщо  є преципітат в пробірці (і  це є помітно в порівнянні  з контрольною пробіркою), треба віддиференціювати його від малих фібринових тяжів. Технологічно це досягається відмиванням, центрифугуванням при низьких температурах. Треба вважати, щоб при відмиванні не втратити кріопреципітат. Якщо під час відмивання зразки продовжують зберігати великого розміру преципітати, можна допустити, що в них є сироватковий альбумін чи поліклональний IgG. Це дає можливість не давати надто високої оцінки присутнім кріоглобулінам і попереджує некоректну інтерпретацію кріоглобулінів 1-го типу, як кріоглобулінів 2-го типу.

   Для наступних  тестів, котрі визначатимуть типи  білків, котрі входять в кріоглобуліни,  є важливим витримати розчин  кріоглобулінів при +37*С.

                                                                                                                            (5)

   З вени забирали 10 мл. Крові поміщали в термостат  37*С отримували тромб і відділяли  його за допомогою центрифугування,  після того сироватку інкубували  при 4*С 8 днів, далі визначали  наявність кріопреципітату. 

                                             ( 7 )

    В кріопреципітатах  визначали антитіла підтипу IgG3 за допомогою імуноферментної техніки.