Клонирование

Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными

экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц,

активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы

мышей. В этих случаях  эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот,

пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в

партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши

развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если

добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом

яйцеклетки, то нормального  развития не происходит, добавление же мужского

ядра приводит к нормальному  развитию. С другой стороны, рекомбинации мужского

и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей

обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских  или двух женских

пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что  для нормального развития млекопитающих  требуются два набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных

видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не

удалось повторить.

Однако эти исследователи  еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982

году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в

энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток

нормально развивались, и  якобы были получены четыре взрослых самки. В свете

вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических  зародышей у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома.

Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс.

Авторы сообщили о пересадке  ядер клеток внутренней клеточной массы  бластоцисты в

энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и

самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и

удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем

реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии

бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три

развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы

использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще  более поздних стадий

(7 суток) и будто бы  получили трех половозрелых мышей.  Однако никто из

работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и

достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней

клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro

реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии

бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность

развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных

яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь  стадии морулы

или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у  мышей клеточные

ядра рано теряют тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней

активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других

млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,

активация первой группы генов  в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-

клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании

эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а  не на мышах. Тем

не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно

расширили наши представления  о методологии клонирования млекопитающих.

 

Кролики, коровы и  свиньи

Американские исследователи  Стик и Робл, используя методику МакГрата и

Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной

породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип  родившихся

полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в

нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически  не

позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически

идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она

показала возможность  клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными  яйцеклетками крупных домашних животных, коров или

овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a

in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)

реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в  матку окончательного

(второго) реципиента - коровы  или овцы соответственно, где  их развитие

происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать

реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем

трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов

реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной

среде, хотя некоторые исследователи  получили неплохие результаты и при

культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером,

пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский

пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-

клеточных эмбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали, чтобы  освободить

пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны

под микроскопом, что значительно  облегчало их удаление. При помощи

манипулятора и заостренной  стеклянной микропипетки извлекали  один из

бластомеров вместе с ядром  из ранних зародышей и переносили его в

энуклеированную зиготу.

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр  и пересажены вперевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали

пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два

зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их

завершилось рождением живых  телят. Если в качестве доноров использовали ядра

2-, 4- или 8-клеточных зародышей,  то реконструированные яйцеклетки  не

развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности, сообщил, что ему

удалось получить четырех  генетически идентичных бычков холстейнской породы в

результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-

клеточного зародыша  (рис. 3). Автор утверждал, что большинство  ядер

сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть

даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие

реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы.

После пересадки в матку  коров - окончательных реципиентов, как полагает

автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные

зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку

синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них

были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате

пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные  ядра зародышей крупного рогатого скота  достаточно

долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие

реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности

клонирования зародышей  крупного рогатого скота практически  решены. Но

остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью,

для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов  свиней посвящена только одна небольшая  работа.

Скудность данных, видимо, и  связана с определенными трудностями  работы с этим

объектом.

 

Клонирование  овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной

стадии развития ядра сохраняют  тотипотентность. Реконструированные

яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались

нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом

цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго

реципиента - еще 60 дней. В  другом случае донорами служили ядра 8-клеточных

зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых  соответствовал

породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и

ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом

случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе

овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок

погиб во время родов. Его  фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы

считали, что в ходе дифференцировки  эмбриональных клеток происходит инактивация

некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже

не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное

развитие реконструированного  зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве

доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in

vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута

получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура

эмбриональных клеток. Клеточную  культуру получали следующим образом: выделяли

микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона

(бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих

пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала

культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после

2-3-х пассажей, клетки становились  уплотненными и морфологически  сходными с

эпителиальными. Эта линия  клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена

как TNT4.

Чтобы донорское ядро и  реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях

клеточного цикла, останавливали  деление культивируемых клеток TNT4 на

определенной стадии (GO) и  ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные

яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные

эмбрионы заключали в  агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец.

Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и  исследовали

под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или  бластоцисты

и пересаживали их в матку  овцы - окончательного реципиента, где  развитие