Этические и правовые аспекты использования животных в экспериментах

- в принципе использование  животных для научных целей  нежелательно, 
- по возможности следует применять методы, не требующие использования животных, 
- при существующем уровне знаний использование животных является неизбежным, 
- моральный долг ученых - гуманно относиться к подопытным животным, по возможности не причинять им боли и неудобства и постоянно стремиться изыскивать способы получения того же результата без привлечения живых животных.

Исследователь должен помнить, что на нем лежит ответственность за общее состояние экспериментальных животных. Они должны содержаться в хороших условиях, получать достаточно нужного корма и обслуживаться квалифицированными специалистами. При планировании экспериментов вначале нужно четко определить, действительно ли необходимы эти опыты на животных. Требуется тщательное изучение литературы, чтобы определить, не сделано ли это другими исследователями.

Существуют методы сравнительной оценки важности проекта и тех страданий, которые при выполнении его будут испытывать животные, позволяющие сказать, насколько оправдан проект (полностью, частично или не оправдан) (Martin, Bateson, 1986, Morton, Griffiths, 1985). В 1959 г. Рассел и Берч (Russell, Birch, 1959) предложили концепцию "трех R" ("The three Rs"), которой следует придерживаться при проведении экспериментов на животных. Она включает три составляющие: replacement - замена, reduction - уменьшение и refinement - повышение качества. Рассмотрим эти составляющие отдельно.

Замена (replacement). Когда это возможно, то надо заменять животных другими моделями и приемами, например, культурами клеток тканей, компьютерными и биохимическими моделями: вместо млекопитающих использовать животных с менее развитой нервной системой, а 5место живых животных - изолированные органы.

Проблеме замены животных на альтернативные модели уделяется очень большое внимание (Smyth, 1978, Rowan, 1984 и многие др.). Альтернативные методы нашли применение в различных областях: при производстве вакцин, в вирусологии, в токсикологических исследованиях, при тестировании безопасности различных продуктов и лекарственных препаратов, в физиологических исследованиях, в санитарно-гигиенических работах. Число животных, используемых в биомедицинских экспериментах в европейских странах, непрерывно снижается, что во многом определяется замещением. Наиболее трудно использовать альтернативы при изучении поведения животных (поведенческие тесты), в экспериментальной хирургии, при исследовании Золи.

В 1969 г. усилиями Дороти Хегарти был создан фонд финансовой поддержки работ по замене животных в медицинских экспериментах (FRAME) (Hegarty, 1995, Annett, 1995). Позже фонды, поддерживающие разработку и внедрение альтернатив, возникли в США, Франции, Швейцарии, Швеции, Бельгии и других странах мира. Разработка альтернатив поддерживается и государственным финансированием. Фонд FRAME организовал выпуск специального журнала"ATLA" (альтернативы к лабораторным животным). Статьи по альтернативным методам публикуются и в других международных журналах: "Toxicology in vitro" (Оксфорд, Нью-Йорк, Сеул, Токио). "ААТЕХ" (альтернативы к использованию животных для тестирования и экспериментов), выпускаемого в Японии, "ALTEX" (альтернативы экспериментам на животных), издаваемого в Германии на немецком языке. В США с осени 1995 г. начал выходить журнал "JAAWS" - журнал о применении законов о защите животных в науке.

По инициативе фонда FRAME созданы Европейский исследовательский Центр для утверждения (валидации) альтернативных методов (ECVAM) и Европейская исследовательская группа по альтернативам в токсикологическом тестировании (ERGATT, Италия). Специальные центры созданы и в других странах, например, в США (СААТ - центр альтернатив к тестированию на животных), в Швеции (MEIC - мультицентр по оценке in vitro тестов на цитотоксичность, основная цель - замена тестов по определению LD50), в Нидерландах (NCA - Нидерландский центр альтернатив к использованию животных).

Информация, имеющая отношение к разработке альтернатив, собирается и анализируется в специальных информационных центрах: в США - информационный центр защиты животных при национальной сельскохозяйственной библиотеке, в Италии - INVITTOX (банк данных по технике in vitro) (Warren et al., 1989), создан по инициативе ERGATT и FRAME, и GDB - банк данных Галилея (информация по итогам тестирования токсических веществ с помощью альтернативных методов in vitro) (Loprieno et al., 1994), а также в Германии - банк данных ZEBET (информация по вопросам защиты животных) (Spielmann et al.,1992). Исследования по созданию альтернативных методов активно поддерживаются университетской федерацией по защите животных Великобритании (UFAW).

Работы в области альтернативных методов ведутся в разных направлениях. Отметим основные из них. Большие успехи достигнуты в использовании культур клеток тканей (методы in vitro) с целью определения общей токсичности химических соединений для человека и животных, для оценки иммунотоксичности, нефротоксичности, гепатотоксичности, нейротоксичности, фототоксичности. раздражающего действия, канцерогенности. Разработаны модели с использованием изолированных органов (например, глазное яблоко) и срезов тканей (кожи, роговицы, почки, мозга и др.). Исследуются и биохимические модели - сложные биополимерные матриксы и трехмерные многослойные структуры. Перспективны и модели с использованием рыб и других гидробионтов (Isomaa et al.,1994). а также растений, насекомых, бактерий и развивающихся эмбрионов позвоночных и беспозвоночных животных.

В качестве примера рассмотрим работы по замене теста Драйза (Draize et al.. 1944), одного из самых болезненных тестов, широко используемого для оценки повреждающего и раздражающего действия различных препаратов на глаза и кожные покровы лабораторных животных. Разработка альтернатив в этой области идет наиболее успешно и есть основания полагать, что тест Драйза в скором времени будет полностью заменен на альтернативные методы. Регулярно проводятся международные конференции по данной проблеме, публикуется большее количество научных работ и отчетов рабочих групп, работающих по специальным программам. Большинство программ по оценке альтернатив тесту Драйза были инициированы в Европе, США и Японии различными индустриальными ассоциациями, группами защитников животных и государственными службами. Одна из таких групп сформирована по инициативе американской ассоциации производителей косметических, туалетных и ароматических средств (CTFA) (Gettings, McEwen, 1990) с целью проведения всесторонней оценки методов, разработанных специально для замены наиболее болезненного окулярного теста Драйза. Работы по замене теста Драйза выполняются по инициативе и финансовой поддержке ассоциации моющих средств (SDA) в США, ассоциации европейских косметических организаций (COLIPA), общества по альтернативам лабораторным животным (JSAAE) и ассоциации косметических предприятий в Японии, организации по защите животных Франции (OPAL), фонда замены животных в медицинских экспериментах (FRAME) в Великобритании и европейского центра по валидации альтернативных методов (ECVAM). Активно поддерживаются эти работы Комиссией Европейского Союза по альтернативным методам, национальным валидационным центром при министерстве здравоохранения Германии и Министерством внутренних дел Великобритании и рядом других организаций во многих странах мира.

Альтернативы тесту Драйза обычно разделяют на три группы: методы предварительной оценки тестируемых веществ, методы определения цитотоксичности и методы оценки токсичности с использованием органа или его частей и их моделей. Иногда в отдельную группу выделяют тесты для оценки способности к восстановлению после воздействия препарата (Rasmussen, Strube, 1994, Langlay, Fisher. 1995).

В первую группу входят методы оценки возможного действия препаратов с помощью анализа физикохимических свойств (Regnier, Imbert, 1992), включая компьютерный анализ структуры с учетом возможной трансформации вещества в организме (Klopman et al., 1993, Barratt, 1995 и др.), а также тесты с физико-химическими детектирующими системами, такие как EYTEXtm, SKINTEXtm, SOLATEXtm и CORROSITEXtm (Courtellement et al.,1992, Regnier et al.,1994, Rasmussen, Strube, 1994 и др.).

Анализ возможного действия нового вещества целесообразно начинать с изучения его физико-химических свойств, например, способности изменять рН среды и буферной емкости. Полезен и компьютерный анализ структуры вещества. Часто уже на этом этапе можно предсказать повреждающее или сильное раздражающее действие соединений. Еще точнее это можно определить по тестам с физико-химическими детектирующими системами (тесты ЕУТЕХТtm, SKINTEXtm, SOLATEXtm, CORROSITEXtm). Три первых метода основаны на спектрофотометрическом измерении оптической плотности белкового матрикса, изменяющейся при взаимодействии с тестируемым веществом. Последний использует химическую детектирующую систему с солями металлов. Все тестирующие системы, кроме первой, включают искусственный барьер, имитирующий кожный.

Самый простой из тестов ЕУТЕХТtm имитирует помутнение роговицы глаза из-за денатурации белков. Тест хорошо работает на определение повреждающего и сильного раздражающего действия, но плохо выделяет вещества нераздражающие. Он довольно широко применяется различными фирмами для скрининга веществ. SKINTEXtm - система создана для выяснения способности химических соединений проникать через поверхность кожи и оказывать на нее воздействие. Тот же принцип положен и в основу теста SOLATEXtm, но он адаптирован для анализа фотореактивности кожных покровов путем ввода в белковый матрикс специальной фотодетектирующеи системы. Оба теста дают очень хорошее совпадение с тестом Драйза. CORROSITEXtm - система объединяет биобарьер и химический детектор, изменяющий свой цвет при разрушении биобарьера и проникновении тестируемого вещества в детектор. Этот тест способен выделять вещества с повреждающим действием.

Вторая группа объединяет тесты на цитотоксичность. Чаще всего в качестве альтернатив предлагаются методы оценки токсичности веществ для первичных и пересеваемых культур клеток роговицы и кожных покровов животных и человека. Наиболее распространенным способом определения степени токсичности веществ является метод измерения связывания специального красителя (neutral red uptake) живыми клетками. Повреждение клетки тестируемыми веществами ведет к снижению поглощения и связывания красителя. Таким образом, измеряя количество связанного клетками красителя, можно оценить степень повреждения клеток. Тесты на цитотоксичность хорошо зарекомендовали себя в опытах с поверхностно-активными препаратами и шампунями, при этом хорошее соответствие с данными in vivo (окулярный тест Драйза) наблюдалось и для веществ нераздражающих, и со слабым раздражающим действием. К перспективным относят и метод измерения скорости метаболизма клеток непосредственно в культуре , помощью силиконового микрофизиометра. Хорошие результаты получены и с использованием метода оценки гемолиза эритроцитов, выделенных из крови животных и человека. После инкубации эритроцитов в среде, содержащей тестируемые вещества, спектрофотометрически оценивается денатурация гемоглобина (первая мишень) и содержание гемоглобина в буферной среде (повреждение мембраны эритроцитов - вторая мишень). Есть основания надеяться, что этот тест позволит выявить различия между нераздражающими препаратами со слабым раздражающим действием на роговицу глаза. Разработаны также методы анализа воздействия химических соединений на монослойные и многослойные структуры клеток, сформированные первичными культурами клеток кожи - фибробластами и кератиноцитами. Эти методы способны реагировать на вещества с низкой кожной раздражимостью.

В третью группу входят тесты на изолированных глазных бокалax, срезах роговицы и кожи, а также многомерные клеточные модем. Обычно используют изолированные глазные бокалы кур, кроликов, быков. Тестируемое вещество наносится на роговицу и через определенное время оценивается его действие по помутнению роговицы, изменению ее толщины и нарушению клеточных структур. Аналогичные показателей воздействия препаратов можно исследовать также на средах роговицы и хрусталиках глазных бокалов, помещенных в специальную среду. Совпадение с данными окулярного теста Драйза достигает 70-90%. Используются и срезы кожи как для оценки повреждающего и раздражающего действия веществ, так и для определения способности тестирующих веществ проникать через кожные покровы. Описанные методы с этических позиций выглядят менее привлекательными в будущем могут иметь ограниченное применение. Наибольшие перспективы имеют трехмерные многослойные модели роговицы, кожи и глаза, в них применяются специальные микропористые субстраты, культуры клеток роговицы и кожи человека и животных. В таких моделях имитируются эпидермис и глубинные слои (модели SKIN2™, EpiDerm™, EPISKIN™, SKIN21000 и 1100, SKIN2ZK1200, SKIN2ZK1300 и др.). Модели позволяют оценивать различные показатели жизнедеятельности клеток и состояние биобарьерной системы. Разрабатываются новые модификации этих моделей с новыми свойствами, предназначенные для оценки действия определенных классов веществ. Несколько таких моделей признаны перспективными и приняты на валидацию.

К третьей группе относят и метод, основанный на оценке воз действия вещества на хориоаллантоисную мембрану развивающегося куриного эмбриона. Яйцо после инкубации в течение 10-14 дне вскрывают, обнажают участок хориоаллантоисной мембраны и нанося на нее определенное количество тестируемого препарата. При экспресстестировании эффект оценивается либо сразу после помещения препарата на мембрану по моментам появления гиперемии, геморрагии, тромбоза и разрушения сосудов и денатурации белков в течение пяти минут после начала тестирования (НЕТ-САМ-тест), либо через 30 минут, определяя дозу (концентрацию), при которой в половин обработанных яиц наблюдается кровотечение, гиперемия или разрыв сосудов (тест CAMVA). Третий метод более длительный. Оценку действия тестируемых препаратов проводят по появлению некроза через два и более дней после нанесения препарата на хориоаллантоисную мембрану. Как показали исследования, НЕТ-САМ-тест дает наилучших результаты. В некоторых работах корреляция с данными in vivo достигала 0,98. Большинство исследователей отмечает хорошее совпадение результатов с окулярным тестом Драйза только для веществ повреждающим и сильным раздражающим действием. Работы по совершенствованию этого теста продолжаются.