Флуоресцентная гибридизация. Принцип FISH-метода

Метод гибридизации in situ модифицирован и разработан в отделе генетики научного центра психического здоровья РАМН.

Помимо простого использования  определенного набора CEP и LSI зондов (клиническая диагностика), существуют более сложные способы постановки FISH, которые, как правило, применяются  для решения исследовательских  задач. Однако не исключено, что в  будущем они станут широко использоваться в клинических целях.

Для исследования опухолевых клеток было предложено использовать комбинацию методов иммунофенотипирования и FISH, получившую название FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms). Для этого анализа используют неокрашенные мазки крови, костного мозга или препараты других тканей. На первом этапе препараты инкубируют со специфическими моноклональными антителами, затем проводят конъюгацию с флуорофорами для последующей визуализации комплекса антиген-моноклональное антитело. Далее осуществляют гибридизацию in situ с ДНК-зондами. Для выявления моноклональных антител и ДНК-зондов используют флуорофоры, различающиеся по цвету. Изучение препарата под флуоресцентным микроскопом при наличии необходимого набора фильтров позволяет одновременно проводить анализ иммунофенотипа и гибридизационных сигналов в интерфазных ядрах.

Цифровая запись микроизображений открыла возможность переведения  в псевдоцвета не только комбинации флуорофоров, но и соотношения их интенсивностей. Этот подход оказался продуктивен для разработки метода многоцветного бэндинга хромосом (MuliColor Banding - МСВ). Данный метод предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения детального анализа отдельной хромосомы. Локус-специфичные ДНК-зонды метят различными флуорофорами или комбинациями флуорофоров так, что уровень сигнала каждого из ДНК-зондов варьирует по интенсивности. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-зондов обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценций различных флуорофоров вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей могут быть переведены в псевдоцвета, и, таким образом, каждой точке изображения, а, следовательно, каждому из хромосомных локусов, будет соответствовать свой псевдоцвет. Данный вариант многоцветного FISH-метода оказался высокоэффективным при анализе не только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Однако для его успешного применения необходимо предварительно определить хромосому, которая будет исследована. Таким образом, данный метод молекулярной цитогенетики подходит для анализа нарушений кариотипа, ассоциированных с определенными хромосомами.Благодаря сохранению пространственной организации хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, МСВ позволяет проводить анализ реорганизации хромосом как в интерфазных ядрах, так и в метафазных. Метафазная цитогенетика, исторически возникшая раньше интерфазной, позволяет определять широкий спектр хромосомных нарушений, но для этого необходимо, чтобы исследуемые клетки находились на стадии метафазы митоза.

Разновидность FISH  метода

Метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genome Hybridization - CGH) был создан для выявления количественных нарушений в геноме. Он основан на проведении реакции гибридизации in situ с использованием в качестве ДНК-зонда всего генома. Исследуемую и нормальную донорскую ДНК метят флуорофорами разного цвета, превращая их таким образом в ДНК-зонды. Эквивалентные количества этих зондов смешивают и используют при гибридизации с контрольным цитогенетическим препаратом. После проведения FISH, метафазы анализируют на флуоресцентном микроскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерного анализа изображений интенсивность флуоресценции двух флуорофоров по всей длине каждой хромосомы. При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться определенное соотношение интенсивности свечения двух флуорофоров. В случае амплификации генов интенсивность сигнала соответствующего флуорофора будет усиливаться, а в случае потери части генетического материала, наоборот, - ослабевать. Таким образом, CGH позволяет выявить геномный дисбаланс. Однако этот метод нельзя использовать для обнаружения сбалансированных транслокаций и инверсий, а трисомии и делеции можно определить только в том случае, если размер несбалансированного участка составляет не менее 10 млн. нуклеотидных пар.

 Многоцветное кариотипирование нашло широкое применение для определения происхождения различных маркерных хромосом, которые часто наблюдаются при онкогематологических заболеваниях. Такой анализ осуществляется при использовании ДНК-зондов сплошного окрашивания к плечам или целым хромосомам (зонды WCP - Whole Chromosome Paint). Эти зонды гибридизуются с многочисленными короткими последовательностями ДНК, расположенными по всей длине хромосомы. Таким образом, при изучении под флуоресцентным микроскопом хромосома выглядит равномерно окрашенной в определенный цвет. Техника сплошного окрашивания хромосом стала предпосылкой для нового способа исследования кариотипа - многоцветного кариотипирования. ДНК-зонды, используемые для такого анализа, состоят из смеси зондов сплошного окрашивания для полного набора хромосом человека, помеченных с помощью комбинации из нескольких флуорофоров, соотношение которых подобрано индивидуально для каждой пары хромосом. Использование соответствующих методов регистрации и компьютерных программ анализа изображений, оценивающих интенсивность свечения всех флуорофоров для каждой точки изображения, позволяет провести кариотипирование, при котором каждая пара хромосом имеет свой уникальный "псевдоцвет". Одновременное использование n числа флуорофоров позволяет одновременно анализировать 2n-1 ДНК-зондов.

Комбинированное использование  прямо- и гаптен-меченых ДНК-зондов позволяет уменьшить число флуорофоров, необходимых для визуализации в метафазе материала всех хромосом человека до трех, однако такая версия многоцветного FISH является значительно более трудоемкой. Существуют различные варианты многоцветного FISH, призванные решать различные задачи в цитогенетической диагностике. В настоящее время используются два основных способа получения псевдомногоцветных изображений. В простейшем варианте используются наборы специфичных комбинаций возбуждающих и запирающих фильтров и устройство для черно-белой цифровой регистрации сигнала. Однако современная техника способна обеспечить регистрацию не только интенсивности сигнала, но и его спектральных характеристик. Такое приборное оснащение лежит в основе спектрального кариотипирования (Spectral Karyotyping - SKY).

M-FISH (Multitarget, Multifluor, Multicolor или Multiplex FISH) является общим названием традиционных многоцветных FISH-методов с использованием комплектов флуорофор-специфичных фильтров. Принцип M-FISH заключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорофоров при последовательной смене комплектов фильтров. Обработка записанной информации, связанной с разделением сигнала и фона, а также с количественной оценкой сигнала, производится с помощью специального программного обеспечения, которое переводит информацию об уровне сигналов флуорофоров в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений количества используемых ДНК-зондов является число доступных флуорофоров с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии и наличие соответствующих комплектов фильтров.

Наиболее широкое распространение  получил такой вариант M-FISH, как 24-цветный FISH, предназначенный для одновременной  идентификации материала всех хромосом человека. Данный метод обладает высокой  эффективностью при детекции хромосомных транслокаций, поскольку каждая пара хромосом окрашена в свой псевдоцвет, но не позволяет выявлять делеции и инверсии. Эта проблема может быть частично решена одновременным окрашиванием хромосом флуоресцентным красителем DAPI, что дает возможность проведения анализа дифференциальной исчерченности хромосом. К сожалению, качество DAPI-бэндинга хромосом после M-FISH существенно уступает даже DAPI-бэндингу после обычной in situ гибридизации . Метод многоцветного бэндинга хромосом (RxFISH) основан на межвидовой in situ гибридизации. Он позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек, осуществляя анализ всего генома человека в одном эксперименте. ДНК-зонды, используемые в RxFISH, помечены комбинацией 3-х флуорофоров, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность.

Такая особенность ДНК-зондов для RxFISH обусловлена способом их получения. Они представляют собой хромосом-специфичные ДНК-библиотеки двух видов гиббонов: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus. В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека. При гибридизации участки ДНК разных хромосом гиббонов, соединенные с различными флуорофорами, взаимодействуют с комлементарными участками ДНК на одной и той же хромосоме человека, создавая тем самым ее цветную исчерченность при изучении с использованием флуоресцентной микроскопии.

К сожалению, применение RxFISH имеет достаточно серьезные ограничения. Так перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного Rx-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям его размера. Более того, зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. К недостаткам RxFISH можно также отнести большой размер многих цветных бэндов, в связи с чем, такие хромосомы человека, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y, представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорофоров и новых ДНК-зондов может значительно повысить разрешающие способности метода. Однако следует признать, что при увеличении числа используемых флуорофоров RxFISH, несомненно, будет более информативным, чем рутинный 24-цветный FISH.

 Основные принципы  анализа микроскопических изображений  при спектральном кариотипировании (SKY) практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения, требующим точного описания спектральных характеристик объекта. В ходе одного измерения получают спектральные кривые для всех точек изображения. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорофоров: один в зеленом спектре, два в красном и два в инфракрасном. Возбуждение и эмиссия всех флуорофоров, используемых при мечении ДНК-зондов, проходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать их последовательной смены, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними проблем. В одном акте экспозиции одновременно для каждой точки изображения записывается полная спектральная характеристика испускаемого света. На основании анализа спектральных кривых определяется наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорофоров. Следующим шагом является процедура классификации, выполняемая с помощью специального программного обеспечения, позволяющего определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Большим достоинством SKY является то, что параллельно спектральной картине регистрируется и окраска DAPI. Возможность параллельного анализа спектрального изображения и качественной дифференциальной окраски хромосом значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов.

 

 Классические методы  цитогенетического анализа позволяют  выявлять лишь около 15% хромосомных  перестроек, идентифицируемых с  помощью SKY. Эта технология является  высоко эффективной и для анализа  результатов FISH в интерфазных ядрах (спектральный FISH). К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорофоров с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии. Это расширяет список пригодных к использованию флуоресцентных меток и увеличивает число одновременно используемых флуорофоров. Более того, включение в список нового флуорофора не требует приобретения нового комплекта фильтров, так как для проведения SKY достаточно одного блока фильтров для спектрального FISH и одного блока фильтров для DAPI. К недостаткам SKY можно отнести длительное время экспонирования, необходимое для записи микроскопических изображений. Также можно ожидать, что SKY является несколько менее эффективным, чем М-FISH, при проведении исследований с относительно небольшими по размеру ДНК-зондами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература:

 

Рубцов Н.Б. Методы работы с хромосомами млекопитающих: Учеб. пособие / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2006. 152 с.

 

Рубцов Н.Б. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ в анализе  хромосомных аномалий. Глава в  книге «Введение в молекулярную диагностику» Т. 2. «Молекулярно-генетические методы в диагностике наследственных и онкологических заболеваний» / Под  ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева. Учебная  литература для студентов медицинских  вузов. М.: Медицина, 2011. Т. 2. С. 100–136.