Флуоресцентная гибридизация. Принцип FISH-метода

История

            Флуоресцентная гибридизация in  situ – это комбинация методов цитогенетики и молекулярной генетики. Принцип метода FISH заключается в гибридизации – связывании ДНК-зонда с хромосомной ДНК исследуемого образца пациента. Зонд представляет собой небольшой фрагмент ДНК, помеченный флуоресцентным красителем, который связывается с определенным участком хромосомы. Далее образцы исследуются с помощью флуоресцентной микроскопии при использовании подходящих для зондов светофильтров. С помощью метода FISH можно идентифицировать целые хромосомы, хромосомно-специфичные области или однокопийные уникальные последовательности, в зависимости от используемых методик маркировки.

Особенностью FISH-метода, принципиально  отличающей его от классического  цитогенетического анализа, является то, что данный метод применим как  для метафазных, так и для интерфазных ядер, что значительно упрощает работу и сокращает время, потраченное на исследование.На сегодняшний день существует широкий спектр ДНК-зондов для всех хромосом, а также для их отдельных участков, центромер и даже генов. Технология FISH позволяет определять количество копий хромосом в каждом сперматозоиде (исследование анеуплоидии).Помимо аномалий кариотипа наиболее частой генетической причиной бесплодия у мужчин являются нарушения сперматогенеза. Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, который контролируется большим количеством генов, расположенных как на аутосомах, так и на гоносомах (половых хромосомах), в особенности на Y-хромосоме. Так, микроделеции локуса AZF  хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин.

Принцип FISH-метода

           В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК. Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, общий вид  протокола для постановки FISH можно  представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического  или цитологического препарата.

Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной  схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза  на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического  препарата используются специальные  осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную  суспензию клеток.

2. Предварительная обработка  (если необходимо).

Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие  белков, которые затрудняют гибридизацию.

3. Нанесение ДНК-зонда  на препарат и последующая  денатурация.

Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры  около 85-90°С.

4. Гибридизация.

После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в  течение нескольких часов (продолжительность  инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время  для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5. Промывка.

После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся  зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6. Контр-окрашивание.

При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска  всей ядерной ДНК.

7. Анализ результатов  при помощи флуоресцентного микроскопа.

ДНК - зонды

            При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин — при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3—4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

FISH может применяться  для различных целей с использованием  зондов трех различных типов:

-локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом,

-альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа,

-зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Материалы  для исследования

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия  опухоли, плацента, эмбриональные ткани  или амниотическая жидкость. Образцы  для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно  из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные  препараты клеток. Меченные флуоресцентными  метками специфические ДНК-зонды  гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным  и чувствительным методом цитогенетического  анализа при выявлении количественных  и качественных хромосомных аберраций,  таких как делеции ( в том  числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на  интерфазных хромосомах служит  быстрым методом пренатальной  диагностики трисомий по 21, 18 или  13 хромосомам или аберраций половых  хромосом. В онкологии с помощью  FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с  гематологическими злокачественными  новообразованиями. Метод также  может использоваться для мониторинга  остаточных явлений онкозаболевания  после химиотерапии и пересадки  костного мозга и выявления  усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных  с неблагоприятным прогнозом  в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля  приживаемости аллотрансплантата  костного мозга, полученного от  индивида противоположного пола.

     FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК. Однако, флуоресцентная гибридизация in situ имеет один существенный недостаток. Зонды являются специфичными только к одному участку генома и, как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или число копий только этого участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов). Поэтому важным является правильная клиническя предпосылка, а FISH анализ может только подтвердить иди не подтвердить диагноз. В последнем случае анализ призодится повторять в отношении сходных синдромов и это далеко не всегда приносит желаемый результат. Альтернативой этому методу является хромосомный микроматричный анализ, который при такой же точности, чувствительности и специфичности определяет количество генетического материала в сотнях тысяч (и даже миллионах) точек генома, что дает возможность диагностики пактически всех известных микроделеционных и микродупликационных сииндромов.

Для создания ДНК проб используют клонированные последовательности ДНК, геномную ДНК, продукты ПЦР-реакции, меченые олигонуклеотиды, а также  ДНК, полученную при помощи микродиссекции.Мечение  зонда может осуществляться разными  способами, например, путем ник-трансляции или при помощи ПЦР с мечеными нуклеотидами.

Процедура гибридизации

На первом этапе происходит конструирование зондов. Размер зонда  должен быть достаточно большим для  того, чтобы гибридизация происходила  по специфическому сайту, но и не слишком  большой (не более 1 тыс п.о), чтобы  не препятствовать процессу гибридизации. При выявлении специфических  локусов или при окраске целых  хромосом надо заблокировать гибридизацию ДНК-проб с неуникальными повторяющимися ДНК-последовательностями путём добавления в гибридизационную смесь немеченой  ДНК повторов (например, Cot-1 DNA). Если ДНК-зонд представляет собой двуцепочечную  ДНК, то перед гибридизацией её необходимо денатурировать.На следующем этапе  приготавливают препараты интерфазных  ядер или метафазных хромосом. Клетки фиксируют на субстрате, как правило, на предметном стекле, затем проводят денатурацию ДНК. Для сохранения морфологии хромосом или ядер денатурацию  проводят в присутствии формамида, что позволяет снизить температуру денатурации до 70°.Далее к препарату добавляют зонды и осуществляют гибридизацию около 12 часов. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся  ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного  микроскопа. Интенсивность флюоресцентного  сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного  красителя.Изменения в генотипе родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, при применении вспомогательных репродуктивных технологий могут передаваться будущему потомству. Этот факт указывает на необходимость предимплантационной генетической диагностики супружеских пар перед проведением программы ВРТ для профилактики рождения больного ребенка.

  Метод FISH можно применять на любом клиническом/исследовательском микроскопе, обладающем функцией получения флуоресцентных изображений, например на микроскопах Olympus, Zeiss, и т.д.

Несмотря на то, что изображения  могут быть получены и проанализированы вручную, для увеличения эффективности  и точности также часто применяется  программное обеспечение для  анализа изображений в сочетании  с автоматизированной микроскопией.Автоматизация метода FISH и развитие таких инновационных технологий, как сравнительная геномная гибридизация являются важным шагом в развитии репродуктивной и перинатальной медицины и ведут к улучшению качества и эффективности диагностики.

Приборы и реагенты для FISH – анализа

        Методы FISH-диагностики стали широко использовать для исследования хромосомных аномалий в интерфазных ядрах, что особенно важно с практической точки зрения, так как метод экономичен и занимает мало времени. В норме, если например у пациента или плода есть дисомия по 21-й хромосоме, к ядре будут видны две флюоресцирующие цветные точки. При наличии трисомии хромосомы 21 (синдром Дауна) будут видны три точки.

Методы молекулярной цитогенетики позволили повысить верифицикацию хромосомных болезней. При использовании обычных цитогенетических анализов - доля невыявленных случаев составила 10 %, при использовании FISH-технологии - снизилась до 0,9-1,5 %. Исследования хромосомных синдромов базируются на основе использования различных типов ДНК-зондов, позволяющих маркировать (метить) индивидуальные хромосомы или их участки. Для успешного практического использования этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. ДНК-зонды в последние годы метят различными цветами (цветные FISH-технологии), что позволяет не только повысить качество анализа и проанализировать количественные и структурные перестройки хромосом, но и осуществлять экспресс-диагностику, что особенно важно для пренатальной диагностики.