Ферменты в органическом синтезе

Молекулярно-динамическое моделирование показало, что 3D структура серин-протеазы субтилизина остается неизменной в растворителях, начиная от высоко полярного ацетонитрила до высоко неполярного октана. В последнем есть четкое разделение объема растворителя от фермента, что позволяет ему сохранить свой активный центр и, в том числе, расположение структурных молекул воды и растворителя, которые не проникают в активный центр. Локализованные молекулы воды и органического растворителя в неводной среде являются прямым продолжением эволюционной пластичности природы в дизайне структуры фермента. Даже в отсутствии воды, ферменты сохраняют способность к "хранению" структурной воды и отталкиванию органических растворителей, все время позволяя переходному состоянию фермента оставаться структурно единым и функциональным.

В результате кинетических экспериментов высокого давления было показано, что разделение зарядов  в переходном состоянии субтилизина сохраняются в неводной среде. Кроме того, дипольный момент не изменяется в растворителях, начиная с воды заканчивая октаном, что свидетельствует о том, что молекулы органического растворителя не проникают в дипольную область переходного состояния, а вместо этого лежат внутри этого белка.

Многие факторы отрицательно влияют на каталитическую функцию ферментов  в органических растворителях. Тем не менее, ситуация не безнадежна и литература изобилует примерами активации ферментов с помощью относительно простых методик, с часто поразительными результатами. Поскольку большинство ферментов используют в качестве гетерогенных катализаторов в органических растворителях, подавляющее большинство методов, разработанных на сегодняшний день, для преодоления низкой активности фермента в неводных средах включают модификации фермента путем лиофилизации. Однако некоторые активирующие подходы обусловлены растворением ферментов в органическом растворителе.

Карбоксилирование ароматических соединений

Декарбоксилаза салициловой кислоты (SDC) может производить салициловую кислоту из фенола; она была обнаружена в дрожжах Trichosporon moniliiforme WU-0401 и была впервые ферментативно охарактеризована, с гетерологичным геном SDC. Sdc - катализируемы обе реакции: декарбоксилирование салициловой кислоты с образованием фенола и карбоксилирование фенола с образованием салициловой кислоты без каких-либо побочных продуктов. Обе реакции были обнаружены без добавления каких-либо кофакторов и протекают даже в присутствии кислорода, предполагая, что Sdc является обратимой, неокислительной и кислород нечувствительной. Таким образом, это легко применимо в селективном получении салициловой кислоты из фенола - ферментативной реакции Кольбе-Шмитта. Выведенная аминокислотная последовательность гена, SDC, кодирующей Sdc содержит 350 аминокислотных остатков, соответствующих 40 кДа белку. Рекомбинантная Escherichia coli BL21 (DE3) выражающая SDC преобразует фенол в салициловую кислоту с 27% (мольн.) выходом при 30 ° С в течение 9 часов.

Реакция Кольбе-Шмитта хорошо известна как реакция карбоксилирования фенолятов щелочных металлов, которая приводит к гидроксибензойной кислоте в условиях высокой температуры и давления. Несколько фенольных соединений, таких как салициловая кислота (Рис.8), гамма-резорциновая кислота и 4-аминосалициловая кислота были получены посредством этой реакции в промышленных процессах и используются в качестве промежуточных соединений для лекарственных средств (Рис.9), гербицидов и промышленных химических веществ. Однако такое производство также генерирует большое количество побочных продуктов, которые затем должны быть отделены.

Рис.8

Рис.9

В последнее время сосредоточено  внимание на биологическом применении реакции Кольбе-Шмитта из-за ее селективности и возможности проводить реакцию в экологически безопасных условиях.

Рис.10  Обратимое ферментативное превращение салициловой кислоты и фенола

Trichosporon moniliiforme WU-0401 преобразует фенол в салициловую кислоту

Анализ ТСХ и двумерный  спектр НМВС показал, что в реакции  целых клеток  штамма WU-0401, смешиваемых  с фенолом и КНСО3, производится салициловая кислота. Целые клетки штамма WU-0401 выращиваемые в LB среде  не показали активности в производстве салициловой кислоты. В противоположность этому, целые клетки штамма WU-0401, выращиваемые в LB среде, дополненной 20 мМ салициловой кислоты, показали желаемую активность. Эти результаты свидетельствуют о том, что ферменты, ответственные за деградацию и производство салициловой кислоты, могут быть индуцированы. Cellfree экстракт штамма WU-0401 также показал производство салициловой кислоты из фенола с KHCO3.

Очистка SDC

Основываясь на активности декарбоксилазы при преобразовании салициловой кислоты в фенол, декарбоксилазу салициловой кислоты очищали до гомогенности из бесклеточных экстрактов штамма WU-0401. Фермент был очищен в 20,8 раз с выходом 5,5%, а удельная активность очищенного фермента для декарбоксилирования салициловой кислоты была 0,47 Ед / мг. Очищенный фермент дал одну полосу 40 кДа на геле SDS–PAGE. Собственная молекулярная масса фермента, установленная путем гель-фильтрации, оказалась равной 140 кДа, в предположении, что фермент имеет гомотетрамерную структуру.

Свойства SDC

Оптимальный рН и температура для деятельности декарбоксилазы были 5,5 и 40 ° С, соответственно. Активность декарбоксилазы была устойчива до 40 ° С и сохраняет 40% своей активности после обработки нагреванием при 50 ° С в течение 1 часа. Активность декарбоксилазы ингибировалась AgNO3, HgCl2, п-хлорортутьбензойной кислотой, в качестве ингибитора сульфгидрильной группы, и NiCl2. Добавление ЭДТА, пиридоксаль-фосфата 50, авидина, биотина, NADH, NADPH к реакционной смеси не имели или имели незначительное влияние на активность фермента. Гидроксиламин, известный ингибитор пиридоксалевых 50-фосфат-зависимых декарбоксилаз, также не имел никакого эффекта. На основании этих результатов предположено, что этот фермент является неокислительной декарбоксилазой, которая не требует кофактора.

Очищенный фермент также катализирует карбоксилирование фенола в салициловую кислоту, что указывает на то, что этот фермент является обратимой декарбоксилазой салициловой кислоты.  Оптимальная концентрация фенола и оптимальная температура для активности фермента были 30 мМ и 30 ° С, соответственно. Активность карбоксилазы была устойчива до 30 ° С и сохраняет 60% своей активности после нагревания при 40 ° С в течение 1 часа. Активность карбоксилазы ингибируется HgCl2, NiCl2, CuCl2, AgNO3, п-хлорортутьбензойной кислотой в качестве ингибитора сульфгидрильной группы, CaCl2 и диэтилпирокарбонатом. Активность фермента была активирована FeCl2.

Список литературы

1. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. Вводный курс и применение в биотехнологии. - М., 1983.

2. Введение в прикладную этимологию. Иммобилизованные ферменты, под ред. И.В. Березина, К. Мартинека, М., 1982.

3. Organic Synthesis with Enzymes in Non-Aqueous Media, Edited by Giacomo Carrea and Sergio Riva, 2008, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

4. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments, Rhett Affleck, Zu-Feng Xu, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 1100-1104, February 1992

5. Enzymatic Kolbe–Schmitt reaction to form salicylic acid from phenol: Enzymatic characterization and gene identification of a novel enzyme, Trichosporon moniliiforme salicylic acid decarboxylase; Kohtaro Kirimura, Hiroaki Gunji, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 394 (2010) 279–284