Ферменты в органическом синтезе

Новосибирский национальный исследовательский государственный  университет

 

 

 

 

 

 

 

Реферат по предмету

"Ферменты в органическом  синтезе"

 

 

 

 

Выполнила:

студентка 4-го курса, ФЕН

………………..

Проверил:

проф., д.б.н.

…………..

 

 

 

 

 

 

2013 г.

Содержание

Основные формы применения ферментов. Иммобилизованные ферменты..........3

Реакции переноса ацильных групп. Применение ферментов в системах с малым содержанием воды......................................................................................................7

Карбоксилирование ароматических соединений....................................................11

Список литературы....................................................................................................14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Основные формы  применения ферментов. Иммобилизованные ферменты.

Ферменты присутствуют во всех живых клетках и способствуют превращению субстратов в продукты. Ферменты выступают в роли катализаторов  практически во всех биохимических  реакциях, протекающих в живых  организмах. Они играют важнейшую  роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма. Ферменты могут применяться в виде целых микробных клеток,  как компоненты гомогенной реакционной смеси, путем добавления раствора фермента к раствору субстратов и других компонентов реакционной смеси, а также в иммобилизованном состоянии. Применение ферментов как компонентов гомогенной реакционной смеси наименее выгодно, поскольку не допускает повторного использования фермента, так как выделение его из реакционной смеси нецелесообразно из-за больших затрат и неминуемых потерь. Поэтому наиболее часто ферменты используются в иммобилизованном состоянии.

Иммобилизованными ферментами называют ферменты, искусственно связанные  с нерастворимым носителем, но сохраняющие  свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами:

• повышенная стабильность;
• простота отделения фермента в активном состоянии от остальной реакционной смеси и возможность многократного использования;
• возможность организации непрерывного процесса.

Существуют различные  способы иммобилизации ферментов. Они включают либо механическое включение (захват) фермента, либо его присоединение  к определенной структуре, или матрице. Преимуществом метода захвата является то, что фермент сохраняется в  естественном состоянии. Однако крупным молекулам трудно добраться до фермента.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

• адсорбция на нерастворимых носителях;
• включение в поры геля;
• пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
• включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Для иммобилизации ферментов  в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность.

В качестве матриц для приоединения ферментов в настоящее время используются природные полимеры и полимеры синтетического происхождения. Природные полимеры могут быть разделены на группы в соответствии с их биохимической природой:

• полисахаридные носители;
• белки;
• липидные носители.

Синтетические полимеры также  могут быть разделены на группы в  соответствии со строением основной цепи полимерных молекул:

• полиметиленовые;
• полиамидные;
• полиэфиры.

Наиболее распространены полисахаридные носители. К ним относятся целлюлоза (Рис.1), декстран (Рис.2), агароза (Рис.3), альгиновая кислота (Рис.4), хитин, хитозан (Рис.5) и их производные.

Рис.1

Рис.2

 

 

Рис.3

\

Рис.4

 

Рис.5

 

 

Полисахаридные удобны в  связи с тем, что имеют большое  количество функциональных групп, к  которым могут быть присоединены бифункциональные активирующие группировки. Эти группировки необходимы, чтобы служить мостиками между матрицей и ферментом при иммобилизации.

В качестве матриц также  могут использоваться и неорганические носители, например, полисилоксановой природы. Их обрабатыают эфирами кремниевой кислоты, при этом кремний встраивается в силоксановую структуру, а функциональная группа остается свободной для связывания с ферментом.

Наиболее распространена иммобилизация ферментов путем  присоединения к нерастворимому носителю - матрице.  По Дж. Порату (1974), идеальные материалы используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими свойствами:

• высокая химическая и биологическая стойкость;
• высокая механическая прочность;
• достаточная проницаемость для ферментов и субстратов, высокая удельная поверхность, высокая емкость, пористость;
• возможность получения в удобном для технологического применения виде (гранулы, мембраны, трубы, волокна, и т.д.);
• простота перевода в реакционноспособное состояние;
• высокая гидрофильность (для проведения взаимодействия с ферментом в водной среде);
• относительно невысокая стоимость.

Матриц, полностью удовлетворяющих  всем требованиям, не существует.

Иммобилизованные ферменты применяются в тонком органическом синтезе (в двухфазных реакционных  средах фермент сохраняет каталитическую активность даже при исключительно  малом содержании воды), в анализе (создание принципиально новых методов "безреагентного" непрерывного анализа многокомпонентных систем органических соединений; биолюминесцентный анализ и иммуноферментный анализ), в медицине (создание лекарственных препаратов пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аллергенностью; решение проблемы направленного транспорта лекарств в организме), в процессах конверсии энергии (вносят ощутимый вклад в осуществление фотолиза воды и в биоэлектрокатализ), в пищевой (получение глюкозо-фруктовых сиропов, глюкозы, яблочной и аспарагиновой кислоты, оптически активных L- аминокислот, диетического безлактозного молока, сахаров из молочной сыворотки и др.) и фармацевтической промышленности (лекарственные препараты).

Реакции переноса ацильных групп. Применение ферментов в системах с малым содержанием воды.

Реакции с переносом ацильных остатков катализируют липазы, эстеразы, амидазы, протеазы. ярким примером таких реакций является реакция переацилирования (Рис.6).

Рис.6

 

Если эта реакция проводится в водной среде, то параллельно протекающая  реакция гидролиза преобладает  из-за высокой концентрации воды (Рис.7).

Рис.7

Для достижения эффективного переацилирования такие реакции проводят в системах с пониженным содержанием воды или в двухфазных системах. При этом концентрация воды в системе понижается и равновесие сдвигается в нужную сторону.

Компоненты в двухфазной системе распределяются между жидкими  фазами в соотвтствии с коэффициентами распределения:

С учетом распределения компонентов  реакционной смеси между двумя  жидкими фазами можно показать, что  константа равновесия будет выглядеть  так:

,

где c_i - концентрации исходных веществ и продуктов, c_w - концентрация воды.

Если коэффициенты распределения  подчиняются условию:

,

то в этом случае K_bp>>K_w, следовательно равновесие смещается в сторону синтеза.

Очень трудно полностью удалить воду из ферментов. Даже после тщательной сушки некоторое количество молекул воды остается тесно связанными с ферментом, и, в большинстве случаев, активность фермента может быть значительно увеличена путем поддержки оптимального количества воды в системе. Таким образом, очень важно контролировать количество воды в реакционной смеси. Например, при отсутствии добавленной воды в тетрагидрофуране (<0,01% (объемн.) воды), содержащем 1М 1-пропанол фермент содержит около 9% (вес.) воды. В этих условиях субтилизин проявляет низкую, но измеряемую активность переэтерификации с NAPCE и 1-пропанолом. Увеличение содержания воды в тетрагидрофуране приводит к увеличению уровня гидратации фермента, до ок. 35% (вес.), в ТГФ, содержащем 70 мкл воды на мл. Уровень гидратации фермента оказывает существенное влияние на каталитическую активность субтилизина в тетрагидрофуране. Добавление 2 мкл воды на мл ТГФ удваивает каталитическую эффективность переэтерификации, в то время как добавление 5 мкл на мл воды увеличивает каталитическую эффективность более чем в 6 раз. Это увеличение каталитической эффективности не связано с увеличением доли активных участков фермента, подверженных воздействию органического растворителя, как эта доля существенно не изменяется при добавлении воды до 20 мк/мл. Однако дальнейшее добавление воды вызывает резкую инактивацию субтилизина по направлению к эфирному субстрату. В частности, увеличение количества воды с 5 мкл до 20 мкл на мл тетрагидрофурана приводит к снижению каталитической эффективности в 7 раз. Это падение активности не из-за конкурирующего гидролиза в присутствии высоких концентраций воды, так как гидролиз подавлен при содержании воды ниже, чем 30 мкл на мл тетрагидрофурана.

Вода имеет решающее значение для жизни, и, следовательно, биологической функции, однако физико-химические свойства этого растворителя являются серьезной проблемой для функций ферментов. Вода имеет высокую концентрацию (55 М), и, следовательно, очень нуклеофильна. В результате, лабильные функциональные группы, такие как функциональные группы нуклеиновых кислот и аминокислот, полисахаридов и углеводов, окисленных интермедиатов метаболических путей могут оказать негативное воздействие на гидролитические свойства воды. Столь высокая концентрация также создает очень большие термодинамические барьеры для синтетических реакций, которые конкурируют с гидролизом, и требуют огромного количества АТФ для преодоления "неблагоприятной термодинамики". Очевидными примерами является репликация ДНК и синтез белка, которые потребляют значительную часть АТФ, требующейся клетке. Биология развивала тщательно продуманные архитектуры, которые контролируют воду в клетках. К счастью, в то время как вода действительно важна, нет необходимости иметь воду в объеме.

Точно установлено, что ферменты могут проявлять каталитическую активность в органических средах. В некоторых случаях проявляемая каталитическая активность в органических средах на несколько порядков ниже, чем в водном растворе. Однако при тщательном выборе типа получения фермента и условий реакции, часто можно достичь каталитической активности того же порядка, что и в воде.

Слабо хаотропный ион калия является основным субъектом во внутриклеточной галофильной среде , и его сопряжение с космотропными анионными поверхностными остатками приводит к максимальной стабилизации биологических макромолекул и способствует растворению белков в клетке. Таким образом, галофилы приспособились процветать в "безводной" среде. В самом деле, галофильные ферменты функционируют в условиях низкого содержания соли, где соль заменяется подходящим органическим растворителем. Например , внеклеточная протеаза из H. halobium, которая требует 4 М NaCl для оптимальной функции , обладает высокой активностью в 0,2 М NaCl в присутствии 40% (объемн.) диметилсульфоксида (ДМСО). Таким образом, органические растворители могут быть использованы для стабилизации галофильных протеаз, а в некоторых случаях устранить необходимость в высоко-солевой среде.

Меняя состав растворителя можно управлять специфичностью реакций ферментативного ацилирования. Эстераза Novozym 435 не способна ацилировать арабинозилцитозин в водной среде, однако, в среде пиридин - гексан (20:80 %, объемн.; активность воды 0.07) при температуре 50 ^оС удается провести реакцию с начальной скоростью 91.1 мМ час^-1 и достигнуть за 6 часов степени превращения >97% с региоселективностью >98%.