Ферменты в клинической диагностики

Активность  α -амилазы в сыворотке крови  часто увеличена при почечной недостаточности, однако не совсем ясно, что является причиной такого увеличения - возрастание образования фермента или снижение его элиминации. В  таких случаях дополнительную информацию может дать определение скорости экскреции α -амилазы или расчет клиренса фермента.

По данным многих авторов, наиболее чувствительным и специфичным тестом для диагностики  панкреатита служит уровень активности П-изофермента α -амилазы. Особое значение этот тест приобретает, если у больного с предполагаемым диагнозом панкреатита  обнаружена нормальная общая активность амилазы. По сниженной активности П-амилазы  может быть диагностирован хронический  панкреатит. Доля П-изоамилаз в обшей  активности α -амилазы значительно  выше в моче, чем в сыворотке  крови, возможно, вследствие различий в экскреции изоферментов почками. Тем не менее диагностическое  значение определения активности изоферментов α-амилазы в моче уступает таковому в крови. 

3.4. у-Глутамилтранспептидаза

В последние  годы в клинической химии подобающее место заняло определение активности у-глутамилтрансферазы (ГГТ; у-глутамил-транспептидазы, КФ 2.3.2.2).

ГГТ катализирует перенос у-глутамила на аминокислоту или пептид, на другую молекулу субстрата  или воду. ГГТ - белок, состоящий из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 90 кДа. Фермент содержит гидрофильный и гидрофобный фрагменты. Активный центр расположен на гидрофильном участке  полипептидной цепи. Гидрофобная  область — часть цепи, которой  фермент прикреплен к мембране. Если экстракцию фермента из тканей провести с использованием в качестве детергента желчных кислот или тритона \ Х-100, ГГТ вместе с гидрофобным участком может быть переведена в раствор. Если в экстрагирующую смесь включены только протеазы (папаин или трипсин), гидрофобный фрагмент ГГТ остается на мембране, а в растворе оказывается гидрофильная часть полипептида ГГТ.

Гидрофильные  фрагменты ГГТ, изолированные из печени или почек, иммунологически  сходны, так же как и гидрофобные  фрагменты ГГТ, изолированные из разных органов.

ГГТ занимает важное место в метаболизме аминокислот. Комплекс биохимических реакций  реабсорбции аминокислот из первичной  мочи, профильтрованной через фильтрационный барьер почечных телец, назван глутамиловым циклом. Этот процесс начинается с  действия ГГТ, которая расположена  на наружной поверхности клеточной  мембраны и связывает аминокислоту первичной мочи с клеткой эпителия канальцев при участии естественного  субстрата глутатиона, образуя тройной  комплекс: аминокислота-ГГТ-глутатион. Отмечено ингибирование реакции  высокими концентрациями субстратов. Как следствие связывания двух субстратов в активном центре фермента происходит перенос глутамиловой кислоты от глутатиона к аминокислоте. В этой фазе цикла аминокислоту переносят  в клетку, где происходят последующие  реакции, в которых глутамиловая цикло-трансфераза расщепляет связь  между амино- и глутамиловой кислотой, потребляя молекулу АТФ. Присутствие  ГГТ на мембране клеток других органов (тонкая кишка, хориоидальное сплетение  и др.) дает основание предположить, что и в этих органах фермент  принимает участие в транспорте аминокислот. Роль ГГТ печени полностью  не выяснена; предположительно фермент  связывает молекулы веществ, которые  необходимо экскретировать.

Биологическая роль фермента связана также с  регуляцией уровня глутатиона в тканях. Именно этим можно объяснить высокий  уровень глутатиона в плазме крови  и моче пациентов с генетически  детерминированным отсутствием  синтеза ГГТ. Регулируя уровень  глутатиона, ГГТ может влиять на синтез белка, что объясняет повышенную удельную активность фермента в тканях с высокой скоростью метаболизма. Это же может быть причиной повышенного уровня фермента в тканях и крови новорожденных.

ГГТ содержится в основном в мембране клеток, обладающих высокой секреторной или адсорбционной  способностью: эпителиальных клетках, выстилающих желчные пути, печеночных канальцах, проксимальных канальцах  нефрона, панкреатической экзокринной  ткани и выводных протоках, ворсинчатых  клетках тонкой кишки. В порядке  снижения удельной активности ГГТ ткани  располагаются в следующей последовательности: почки, печень, поджелудочная железа, Щеточная кайма клеток тонкой кишки. Активность ГГТ не обнаружена в скелетных  мышцах и миокарде.

Клиническое значение определения концентрации ГГТ в сыворотке крови

Наиболее частая причина повышения активности ГГТ  в сыворотке крови — патология  печени. Слабое токсическое воздействие  на печень, вызывающее жировую инфильтрацию, прием алкоголя и лекарственных  препаратов сопровождаются умеренным  увеличением активности ГГТ. Более  выраженное повышение активности фермента связано с внепеченочной и  внутрипеченочной обструкцией, вторичным  вовлечением печени в онкологические процессы организма путем метастазирования. Самая высокая активность ГГТ в сыворотке крови отмечена при закупорке желчного протока или злокачественных опухолях, прямо или опосредованно поражающих печень.

При отсутствии желтухи определение ГГТ —  чувствительный тест для выявления  патологии печени; клиническая чувствительность выше, чем у таких ферментов, как  ЩФ и 5-нуклеотидаза. При онкологических заболеваниях нормальная активность ГГТ  в сыворотке крови свидетельствует  об отсутствии метастазов в печени, тогда как высокая активность ГГТ (в 12 раз и более выше нормы) служит индикатором поражения печени метастазами. При остром вирусном гепатите многократное исследование активности ГГТ позволяет следить за течением болезни: постоянно увеличенная  активность ГГТ указывает на развитие хронической формы заболевания. При увеличении активности ЩФ и трудностях определения ее изоферментов полезно  определять активность ГГТ для идентификации  возможного источника гиперферментемии: активность ГГТ остается в пределах нормы, если увеличение активности ЩФ вызвано костным изоферментом, и увеличена, когда фермент образуется в печени. В педиатрии определение активности ГГТ предпочтительнее, чем определение ЩФ, так как активность ГГТ не меняется с возрастом и полученные результаты легче интерпретировать.

Высокая активность ГГТ присутствует в крови людей, злоупотребляющих алкоголем. У 74% алкоголиков, страдающих гистологически подтвержденным поражением печени, увеличение активности ГГТ было постоянным даже в периоды абстиненции. Существуют определенные различия между активностью ГГТ в крови алкоголика и человека, принявшего значительную дозу алкоголя. У первых наступает увеличение активности ГГТ до 140% от нормальных значений с пиком активности через 18 ч, у вторых даже после тяжелого опьянения увеличение активности ГГТ не превышает 15% в течение 12 ч.

Развитие инфаркта миокарда сопровождается изменениями  активности ферментов сыворотки  крови (КК, ЛДГ, ACT) и ГГТ, активность которой после приступа стенокардии остается повышенной в течение длительного времени. Повышение активности ГГТ отмечено у 50% больных стенокардией и у части пациентов с другими заболеваниями (коронарная недостаточность, недостаточность кровообращения). При инфаркте миокарда остаются неясными механизмы увеличения активности ГГТ, поскольку она отсутствует в сердечной мышце.

Активность  ГГТ в моче выше, чем в сыворотке крови. Присутствующая в моче ГГТ имеет почечное происхождение: фермент выделяется в мочу из разрушенных клеток проксимальных отделов канальцев, которые содержат ГГТ в высокой концентрации.

3.5.Креатинкиназа  (КК)

Креатинкиназа-АТФ: креатин-1,4-фосфотрансфераза (КФ 2.7.3.2) —  катализирует обратимый перенос  фосфатного остатка между АТФ  и креатином с образованием АДФ  и креатинфосфата. Общепринято сокращенное  название фермента — креатинкиназа (КК). КК — цитозольный и митохондриальный фермент, который функционирует  в клетках многих тканей. Продукт  реакции фосфокреатин - макроэргическое  соединение, обеспечивающее энергией сокращение мышцы, ее расслабление и  транспорт метаболитов в миоцит. В первое время активность КК в  крови интересовала клинических  химиков как тест для выявления  поражения поперечнополосатой мускулатуры. В настоящее время активность КК — ведущий тест в диагностике  инфаркта миокарда.

Наибольшее  содержание КК отмечено в миокарде и скелетных мышцах, высокое содержание — в языке, мышце диафрагмы, низкое — в почках, легких, печени. КК —  димер; в цитозоле клеток тканей человека присутствуют 2 субъединицы: М - мышечный тип и В — мозговой тип. Субъединицы  представляют собой белки с молекулярной массой 41кДа с активным центром  в каждой субъединице. Соответственно двум формам субъединиц димерная форма  молекулы КК имеет следующие варианты: мышечный тип КК-ММ, гибридный димер  КК-МВ, характерный для миокарда, и изофермент КК-ВВ, локализованный преимущественно в мозговой ткани.

Активность  фермента и распределение его  изоферментов органоспецифичны, поэтому  идентификация и количественное определение изоферментов КК в сыворотке  крови не только полезно для установления увеличения проницаемости мембран  или повреждения специфического органа, но и дает возможность установления диагноза, наблюдения клинического течения  и оценки прогноза заболевания. В  электрическом поле наибольшей подвижностью обладает КК-ВВ, наименьшей - КК-ММ, гибридная  форма КК-МВ занимает промежуточное  положение. В соответствии с этим в классификации Международного союза теоретической и прикладной химии КК-ВВ обозначена изоферментом I КК, КК-МВ - II, КК-ММ - III. Для понимания  источников появления в крови  активности КК-МВ следует отметить, что у плода до 16-недельного возраста в мышечной ткани доминирует зародышевая  форма КК, а именно КК-МВ, которая  позже замещается КК-ММ. Определенная перестройка изоферментного состава  КК происходит и при гипертрофии  миокарда: повышается процентное содержание КК-МВ и КК-ВВ, а доля КК-ММ оказывается  сниженной. Миоциты в условиях длительной гиперфункции повышают синтез изоформы КК-ВВ.

Клиническое значение определения активности КК и ее изоферментов.

Повышение активности КК в крови может быть следствием травмы, переохлаждения или перегревания, голодания и бактериальной интоксикации, дегидратации, поражения электрическим  током. Повышенная активность КК-МВ отмечена при мышечной дистрофии разной этиологии, ишемическом рабдомиолизе с миоглобинурией, отравлении угарным газом. Активность КК-МВ повышалась, более чем на порядок  превышая норму, у больных острым перикардитом.

Опыт применения изоферментной диагностики в  блоке интенсивной терапии показал, что повышение в крови активности КК-МВ может происходить при выраженной недостаточности кровообращения, катетеризации  сердца, отеке легких, аритмиях, кардиогенном шоке, алкогольной интоксикации, кровотечении из ЖКТ, травматической эпилепсии, травме грудной клетки. Активность КК-МВ повышена в крови пациентов при синдроме шока, развившемся при анемии, гиперкапнии, гипоксемии, молочнокислом ацидозе, выраженной гипотонии. Однако только в  редких случаях в указанных ситуациях  активность КК-МВ на 6% превышала активность КК. Учитывая возможности неспецифического повышения активности КК-МВ, надо помнить  и о возможности пропустить небольшой  инфаркт миокарда. У больных с  гипертрофией миокарда активность КК-МВ в период инфаркта может достигать 1/3 активности КК.

Повышение активности КК в сыворотке крови может  быть обусловлено увеличением активности изофермента КК-ММ. Активность КК-ММ в сыворотке крови повышается при прогрессирующей мышечной дистрофии, дерматомиозите, полимиозите, инфаркте миокарда, гипотиреозе, некоторых заболеваниях нервной системы. Активность КК-ММ увеличивается  также после физической нагрузки, внутримышечных инъекций, хирургических  операций. При мышечной дистрофии  типа Дюшенна (наследственном, связанным  с полом рецессивном заболевании) активность КК-ММ увеличивается в 8-90 раз по сравнению с нормой, активность изофермента увеличена также  у носителей этого гена.

Активность  КК-ВВ в крови отмечали во время  аортокоронарного шунтирования. Полагают, что активность КК-ВВ может быть тестом аноксии тканей. Активность КК-ВВ в крови может также быть следствием гипоксического повреждения  мозга, особенно в условиях перинатальной  гипоксии. Активность КК-ВВ увеличена  у 53% новорожденных с асфиксией. КК-ВВ присутствует в гладкой мускулатуре, но не определяется в сыворотке крови  лиц с доброкачественными заболеваниями  этих тканей. Одним из возможных  объяснений повышения активности КК-ВВ в крови при сосудистых операциях  служит предположение, что стенки вен, как, впрочем, и аорты, содержат только одну изоформу КК, а именно КК-ВВ. Активность изофермента КК-ВВ может быть повышена в крови при раке предстательной железы, мелкоклеточном раке легкого, аденокарциноме желудка, лейкозах, хронической  почечной недостаточности, передозировке  миорелаксантов. Метастазирование рака предстательной железы сопровождается особенно высокими цифрами активности КК-ВВ в крови. Исследователи сходятся во мнении, что активность КК-ВВ может  быть использована как неспецифический  маркер опухолевого процесса.

В ряде случаев  при инфаркте миокарда, а иногда и в его отсутствие высокая  активность КК сохраняется неопределенно  долго. Наблюдаемые явления обусловлены  циркуляцией в крови необычных  форм КК и ее изоферментов. После  разделения при ЭФ фракций КК на электрофореграмме становятся видимыми полосы, не соответствующие положению  полос КК-ММ, КК-МВ и КК-ВВ, и можно  отметить наличие изоформ КК, движущихся к катоду, что из белков сыворотки  крови свойственно иммуноглобулинам. Известно, что окисление сульфгидрильных  групп КК изменяет электрофоретическую  подвижность молекул, однако при  этом они по-прежнему движутся к  аноду. У больных метастазирующим  раком предстательной железы выделен  изофермент КК, мигрирующий между  КК-МВ и КК-ВВ. 

3.6. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) 

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; L-лактат-НАД-оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27) - цинксодержаший фермент, катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную кислоту при участии НАД-Н₂.

Фермент в  кристаллической форме был получен  из мышцы сердца. Подобным же образом  были получены кристаллические ферментные препараты из скелетных мышц и  печени. При рН 7,0 равновесие реакции  смещено в сторону образования  лактата, в щелочной среде реакция  проходит в обратном направлении. ЛДГ  может также реагировать с  НАДФ в качестве кофермента, но значительно  медленнее, чем с НАД.

ЛДГ - тетрамер; два локуса генов кодируют синтез двух олигомеров — М- и Н-субъединиц. М-субъединица синтезируется главным  образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как Н-субъединица  присутствует в тканях с преобладанием  аэробных процессов. Молекулярная масса  каждой субъединицы составляет 35 кДа, каждого тетрамера - 140 кДа. Полипептидная  цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25% длины полипептидной  цепи. В тетрамерной структуре  ЛДГ субъединицы связаны силами ионных и водородных взаимодействий. На каждой субъединице расположен каталитический центр; диссоциация тетрамера на димеры или мономеры приводит к потере ферментативной активности.