Дріжджі роду Candida та їх практичне використання у промисловій біотехнології

Зазвичай ферментацію проводять протягом 5 діб при рН 5,5 - 7,7. Після використання сахарози (приблизно через 30 год.) починає помітно накопичуватися вітамін В2, спочатку - в міцелії, а потім - в культуральній рідині. Всю біомасу висушують і отримують сухий продукт із залишковою вологістю 8%, що містить 1,5-2,5% рибофлавіну, 20% білка, тіамін, нікотинову кислоту, піридоксин, ціанкобаламін, мікроелементи та інші речовини, рекомендують для годування тварин.

У разі високих вихідних показників по рибофлавіну, вітамін В2 можна виділяти в індивідуальному стані і, разом з синтетичним рибофлавіном, використовувати в медицині.

 

4.2 Спосіб очищення  води і грунту від забруднення  нафтою та нафтопродуктами

 

В забруднене середовище вводять суспензію клітин дріжджів C. guillermondii ВКПМ У-241 з мінеральними добавками: азот в амонійній формі у кількості 15 - 2500 мг/л, фосфор в фосфатної формі в кількості 10 - 1500 мг/л.

Відомий селекційований у тривалому безперервному процесі природний штам вуглеводневоокислювальних дріжджів C. guilliermondii ВСБ-569, активно розвивається при рН середовища 3,5 - 6,0 і окислює комплексоутворюючі сполуки нафтового дистиляту нафти, що розвивається на сирій нафті (параніно-нафтенового типу) і кубовому залишку.

Штам непатогенний і нетоксичний.

У лабораторних експериментах визначено ефективність очистки води цим штамом від забруднень нафтою (1% об. нафти у водопровідній воді) при температурі 30 0С, без додавання поживних солей. На четверту добу глибина утилізації вуглеводнів складає близько 42%, а по ароматичних вуглеводнях близько 35%.

При зниженні рН середовища нижче 3,5 або перевищенні вище 6,0 спостерігається зниження швидкості росту культури та уповільнення процесу споживання вуглеводнів. При зменшенні концентрації азоту і фосфору нижче 15 і 10 мг/л відповідно спостерігається значне зниження питомої швидкості росту за рахунок лімітування, при завищенні верхніх меж названих діапазонів спостерігається явно виражене інгібування.

Для отримання біомаси клітин штаму Candida guilliermondii ВСБ-569 культуру вирощують на рідкому поживному середовищі наступного складу:

- NH4H2PO4 10 г/л;

- K2HPO4 10 г/л;

- MgSO4 0,7 г/л;

- FeSO4·7H2O 12,5 мг/л;

- ZnSO4 ·7H2O 12,5 мг/л;

- MnSO4 ·5H2O 12,5 мг/л;

- CuSO4 5H2O 3 мг/л.

В якості єдиного джерела вуглецю використовують н-парафіни, отримані карбамідною депарафінізацією з високим вмістом ароматичних вуглеводнів (0,5 - 0,8%).

Процес культивування проводять безперервно або періодично при 20-360С і рН 3,5-6,0 в аеробних умовах.

При необхідності збільшення терміну зберігання отриману біомасу дріжджів можна висушити на розпилювальній сушарці у м’яких умовах. 
Приготування суміші перед вживанням полягає в розведенні біомаси водним розчином азотфосфорних мінеральних добавок.

 

4.3 Біосинтез лимонної  кислоти дріжджами на середовищі  з гліцерином

 

У різних патентах повідомляється про використання спеціально селекціонованих мутантних штамів дріжджів для отримання лимонної кислоти, часто використовують дріжджі Yarrowia lipolytica. Раніше ці дріжджі позначалися як вид Candida lipolytica або Saccharomycopsis lipolytica. Фактично, найменування Candida lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica і Yarrowia lipolytika є синонімами.

В якості продуцента лимонної кислоти відібраний штам Yarrowia lipolytica 704. Для відбору штамів розроблений селективний експрес-метод з використанням агаризованого середовища, що включала в себе лімітуючу концентрацію амінного азоту і надлишок гліцерину. Досліджено умови культивування, що стимулюють процес біосинтезу лимонної кислоти. При культивуванні природного штаму Y. lipolytica 704 в середовищі з гліцерином відбувається накопичення 110,0 г/л лимонної кислоти.

Лимонну кислоту (ЛК) отримують мікробіологічним способом у всіх промислово розвинених країнах. Щорічно в світі виробляється більше 1 млн. 400 000 т ЛК, а річний приріст виробництва складає 5% від існуючого рівня.

При традиційному способі отримання ЛК в якості продуцента використовують міцеліальні гриби Aspergillus niger, основною сировиною є бурякова меляса - відхід виробництва цукру. Вміст цукру в мелясі не перевищує 50%, решта 50% - це баластні речовини, які не використовуються продуцентом і викидаються в навколишнє середовище (є відходами виробництва). Крім того, передбачається обов’язкова обробка меляси фероціанідами для видалення надмірного вмісту мікроелементів. Таким чином, традиційний процес виробництва ЛК з меляси є складним та екологічно небезпечним.

Умовою синтезу ЛК дріжджами є лімітування їх зростання мінеральними компонентами середовища (N, P, S або Mg) при надлишковому змісті джерела вуглецю. Як джерело вуглецю використовують н-алкани, етанол, рослинні масла і глюкоза.

В даний час спостерігається тенденція розширювати сировинну базу мікробіологічної промисловості за рахунок використання гліцерину. Гліцерин можна віднести до перспективних джерел вуглецю для мікробіологічної промисловості, ресурси якого значно збільшуються внаслідок успішного розвитку технології хімічного синтезу, а також за рахунок його отримання з рослинних відходів і відходів виробництва біодизелю.

Відомості щодо зростання мікроорганізмів у середовищі з гліцерином поодинокі. Дослідженнями, проведеними в ІБФМ РАН, виявлено ряд культур дріжджів роду Candida, активно засвоюють гліцерин. 

Культури підтримують при +4 0С на сусло-агарі, пересів проводять один раз в 3 місяці.

Кислотоутворення дріжджів оцінюють на селективному середовищі з крейдою в чашках Петрі. Склад середовища:

• гліцерин - 20,0 г/л;
• МgSO4×7H2O - 0,7 г/л;
• Ca(NO3)2 - 0,4 г/л;
• NaCl - 0,5 г/л;
• КН2РО4 - 1,0 г/л;
• К2НРО4 - 0,1 г/л ,
• дріжджовий автолізат - 8,0 мл / л (вміст амінного азоту не вище 60 мг/л),
• мікроелементи по Буркгольдеру;
• бакте-агар - 20,0 г/л. 

Безпосередньо перед розливом в чашки в розігріте середовище вносять крейду (СаСО3 - 6,0 г/л). Після повного охолодження середовища репліка тором наносять клітини досліджуваних культур. Інкубацію проводять протягом 6 діб при 29 0С.

Культивування природного штаму Y. lipolytica 704 проводять в ферментері об'ємом 10 л (вихідний об'єм середовища 5,0 л). Автоматично підтримують температуру (29,0 ± 0,1 0С), концентрацію розчиненого в середовищі кисню (55-60% від насичення), рН середовища 5,0 (підтитровкою 20%-вим розчином NaOH).

Середовище мала наступний склад:

• гліцерин;
• (NH4)2SO4 - 6,0 г/л;
• МgSO4×7H2O - 1,4 г/л;
• Ca(NO3)2 - 0,8 г/л;
• NaCl - 0,5 г;
• КН2РО4 - 2,0 г/л;
• К2НРО4 - 0,2 г/л;
• дріжджовий екстракт - 0,5 г/л;
• подвоєний розчин мікроелементів по Буркгольдеру;
• тіамін - 0,5 мг / л.

 

 Час культивування - 144 год.

Ріст дріжджів контролюють за вагою сухої біомаси, яку визначають фільтруванням культуральної рідини через мембранні фільтри з наступним висушуванням фільтрів до постійної ваги.

Для визначення змісту ЛК і трео-D-ізолимонної кислоти (ІЛК) використовують метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Елюцію ведуть при наступних умовах: швидкість елюції 1 мл/хв, температура 35 0С, в якості буфера використовують фосфорну кислоту 20 мМ. Для розділення ЛК і ІЛК застосовують колонку зі зверненою фазою. У роботі використовють ВЕРХ хроматограф. Реєстрацію кислот проводять при довжині хвилі 210 нм. Органічні кислоти ідентифікують відповідно до стандартів ЛК і ІЛК.

Крім того, вміст ЛК і ІЛК в культуральній рідині визначають ензиматично з використанням діагностичних наборів. 

Вміст гліцерину визначають ензиматичні з використанням діагностичного набору.

Кількість амонійного азоту в середовищі визначають за допомогою іонометра.

Питому швидкість росту культури (μ, год-1) розраховують за формулою:

де m1 і m2 - вага сухої біомаси (г/л) в момент часу t1 і t2 (год.).

Питому швидкість кислотоутворення (qp, г кислоти / г біомаси на год.) розраховують за формулою:

де R1 - кількість утвореної кислоти на момент часу t1, г;

R2 - кількість утвореної кислоти на момент часу t2, г;

m1 і m2 - вага сухої біомаси в момент часу t1 і t2, г.

Вихід кислоти зі спожитого субстрату (Ys, г/г) визначають за рівнянням: 

де С - загальна кількість кислоти в кінці культивування, г;

S – кількість спожитого  субстрату (гліцерину або відходів) за період росту і кислотоутворення, г.

Розрахунок виходу біомаси зі спожитого гліцерину (Yx/s):

де X — суха вага клітин (в граммах) на 1 л середовища;

S — вага субстрату (в  граммах) на 1 л середовища;

S0 — початкова вага субстрату (в граммах) на 1 л середовища.

Розрахунок енергетичного виходу ЛК.

 

де V - енергія господарсько-цінної частини і побічної продукції 

Е - використаної сукупної енергії.

Досліди повторюють не менше трьох-чотирьох разів, у кожній точці проводиться два-три паралельні вимірювання.

Відбір штаму продуцента ЛК. Кислотоутворюючу здатність штамів оцінюють по зонам розчинення крейди, які утворюються за рахунок виділення органічних кислот на твердому середовищі. Метод був запропонований Lodder (1970). В основу підготовки середовища покладено три основні ознаки: надлишок гліцерину, лімітуюча концентрація азоту     (60 мг/л) і використання тільки органічного джерела азоту (дріжджового автолізат) замість (NН4)2SO4. Колонії розсівають за допомогою реплікатора на чашки Петрі з агаризованому середовищем Рідер (не більше 5 колоній на чашку) Кислотоутворення дріжджів на агаризованих середовищах, які містять гліцерин у якості джерела вуглеводів показано на рисунку 4.1.

При зростанні дріжджових організмів у процесі виділення кислот навколо колоній з'являються різні за величиною чітко візуально помітні зони розчинення крейди, відповідні кількості утворених кислот; після 6 діб інкубації при температурі 29 0С вимірюють їх ширину. На малюнку 1 показано кислотоутворення на твердому середовищі 5 штамів дріжджів С. lipolytica. Всі штами добре ростуть на середовищі з гліцерином і синтезують кислоти. Отримані результати представлені в таблиці 4.1.

Лімітування зростання приводять до екскреції кислот у 34 штамів (33 штаму Y. lipolytica і 1 штам C. paludigena). Серед Y. lipolytica 8 штамів не утворюють кислот. Штами-кислотоутворювачі розрізняються по зоні розчинення крейди. Як видно з таблиці 1, 16 штамів мають зону розчинення крейди, рівну 0,5-2 мм, 9 штамів мають зону розчинення крейди, рівну 2,5-4 мм, 3 штами мають зону розчинення крейди, рівну 4,5-6 мм, 5 штамів мають зону розчинення крейди, рівну 6,5-8,0 мм, і 1 штам (Y. lipolytica 704) має зону розчинення крейди вище 8,5 мм.

Для подальшої роботи в якості найбільш активного продуцента використовують штам Y. lipolytica 704, у якого зона розчинення максимальна (більше 8,5 мм).

Підбір оптимальних умов кислотоутворення. Досліджують вплив pH середовища, аерації та вмісту гліцерину на кислото утворюючу здатність природного штаму Y. lipolytica 704.

 

1 - Y. lipolytica 683; 2 - Y. lipolytica 704; 3 - Y. lipolytica 79;                             4 - Y. lipolytica 695; 5 - Y. lipolytica 571

Рисунок 4.1 - Кислотоутворення дріжджів на агаризованих середовищах, які містять гліцерин у якості джерела вуглеводів

 

Досліди проводять за наступною схемою: клітини, що знаходяться у фазі активного кислотоутворення (біомаса 10 г/л і ЛК 18 г/л), відбирають з ферментера, відокремлювали від культуральної рідини центрифугуванням, двічі промивають 0,9% розчином NaCl і суспендують в 50 мМ фосфатному буфері (pH = 7,0). Клітинну суспензію вносять в колби об’ємом 750 мл з 50 мл середовища Рідер без азоту і вітамінів, яка містить гліцерин, та інкубують на качалці при 29 0С протягом 22 год. За час досліду величина pH знижується незначною мірою (на 0,5-0,3 одиниці), і концентрація клітин залишається сталою (на рівні 3,0 ± 0,3 г/л).

 

Таблиця 4.1 - Кислотоутворююча здатність дріжджів роду Candida (Yarrowia), які ростуть на гліцеринвмісному агаризованому середовищі з крейдою

Вид дріжджів	D, мм	Вид дріжджів	D, мм
Candida brumptii ВКМ Y-5	0	Y. lipolytica 374/3	1,5
C. rugoza ВКМ Y-67	0	Y. lipolytica 374/4	0,5
С. olea ВКМ Y-57	0	Y. lipolytica 374/5	2
C. paludigena ВКМ Y-2443	2,0	Y. lipolytica 374/6	0
C. pelliculosa ВКМ Y-118	0	Y. lipolytica 374/8	1
C. catanulata ВКМ Y-36	0	Y. lipolytica 387	2
C. zeylanoides ВКМ Y-6	0	Y. lipolytica 571	2
C. zeylanoides ВКМ Y-14	0	Y. lipolytica 581	1
C. zeylanoides ВКМ Y-2324	0	Y. lipolytica 582	2
C. zeylanoides ВКМ Y-2595	0	Y. lipolytica 585	1
C. guilliermondii H-P-4	0	Y. lipolytica 591	0
Torulopsis candida 127	0	Y. lipolytica 607	3,5
T. candida 420	0	Y. lipolytica 645	4
Yarrowia lipolytica 12a	0	Y. lipolytica 646	1
Y. lipolytica 9b	3	Y. lipolytica 655	0
Y. lipolytica ВКМ Y-47	0	Y. lipolytica 666	0
Y. lipolytica 68	0	Y. lipolytica 667	8
Y. lipolytica 69	3	Y. lipolytica 668	1,5
Y. lipolytica 76	1	Y. lipolytica 670	0,5
Y. lipolytica 79	2	Y. lipolytica 672	0
Y. lipolytica 86	8	Y. lipolytica 681	4,5
Y. lipolytica 212	8	Y. lipolytica 683	7
Y. lipolytica 214	4	Y. lipolytica 694	5
Y. lipolytica 281	4	Y. lipolytica 695	3