Дріжджі роду Candida та їх практичне використання у промисловій біотехнології

 

Зрілі клітини містять велику вакуоль. Функції її точно не встановлені. Показано, що в ній містяться гідролітичні ферменти, поліфосфати. ліпіди, низькомолекулярні клітинні інтермедіати та іони металів. Ймовірно, що вакуоль діє як резервуар для зберігання поживних речовин і гідролітичних ферментів.

Включення - запасні речовини(глікоген, поліфосфати (волютин), жири у вигляді окремих крапель).

Нейтральні жири (тригліцериди), в особливо великих кількостях відкладаються у вакуолях. Дріжджі роду Candida можуть накопичувати до 80% жирів по відношенню до сухої речовини.

Вміст запасних жирів визначається складом поживного середовища (високим відношенням C / N), і ці жири можуть бути виділені безпосередньо з клітин. Кількість інших ліпідних сполук від складу середовища майже не залежить. Ці ліпіди звільняються лише після гідролізу білків і полісахаридів і являють собою компоненти ліпопротеїнів, що входять до складу плазматичної мембрани і внутрішніх мембран, і ліпополісахаридів.

C. pulcherrima містять пульхеррімін-пігмент. Як і С. reukaufii ці дріжджі можна виділити з нектароносних квіток і з плодів, а також з кишечника бджіл. На середовищах, що містять залізо, вони утворюють темно-червоні колонії. Їх червоний піразиновий пігмент, нерозчинний у воді та інших розчинниках, містить комплексно зв'язане залізо.

Гриби C. albicans виробляють фермент β-N-ацетилгалактозамінідазу.

Хімічний склад дріжджів роду Candida залежить від виду та умов культивування. Вони містять у середньому 75 % води та 25 % сухої речовини, яка містить неорганічні речовини, вуглеводи, азот, білки, ліпіди. Основними неорганічними речовинами є фосфорна кислота (близько 50%) та калій (близько 25 %).

 

3 ФІЗІОЛОГІЯ ТА МЕТАБОЛІЗМ МІКРООРГАНІЗМІВ

РОДУ CANDIDA

 

3.1 Особливості харчування

 

Дріжджі роду Candida є хемоорганогетеротрофними організмами. Поглинання органічних речовин у них здійснюється осмотрофно.

Більшість з них є сапрофітами: існують у філосфері та ризосфері рослин, ґрунті, морській і прісній воді, інших природних субстратах. Розвиваються  також у шлунково-кишковому тракті, на поверхні шкіри тварин. Представники роду Candida є представниками нормальної флори людини (комменсалами) і виявляються зазвичай на шкірі, в шлунково-кишковому тракті, на слизових оболонках рота і жіночих статевих органів.

Дріжджі роду Candida здатні рости на багатьох субстратах: вуглеводнях (C. tropicalis), метанолі (C. boidinii), гідролізатах торфу та целюлози (C. utilis),  етанолі (C. utilis) тощо.

При осмотрофному живленні(піноцитозі) організм поглинає розчинену органічну речовину шляхом абсорбції, без утворення травних вакуолей. Зазвичай абсорбуються низькомолекулярні органічні речовини, які утворюються при розщепленні високомолекулярних сполук різноманітними гідролітичними екзоферментами. Їх екзоферменти здатні розкладати до мономерів такі біополімери як целюлозу, лігнін, хітин, білки, нуклеїнові кислоти тощо.

Окрім вуглеводів можуть засвоювати також жири, вуглеводневі, ароматичні та одновуглеводні споуки, спирти, органічні кислоти. 

Універсальним джерелом азоту для дріжджів роду Candida є солі амонію. Вони мають дві ферментні системи: перша відновлює нітрат до нітриту, друга - нітрат до амонію. Використовують як джерело азоту сечовину, розщеплюючи її до СО2 і NH3.

 

3.2 Дихання

 

При зростанні в аеробних умовах при низькому вмісті глюкози в середовищі дріжджі роду Candida отримують АТФ за рахунок процесів дихання, як це робить більшість аеробних організмів. Повне окислення субстрату до вуглекислого газу і води може відбуватися за допомогою трьох різних механізмів: в циклі трикарбонових кислот, в гліоксилатному циклі і в пентозафосфатному циклі.

 

 

3.3 Лімітуючі фактории

 

Серед дріжджів роду Candida немає яскраво виражених екстремофілів, тобто видів, що віддають перевагу вкрай високим або низьким значенням температури, рН, осмотичного тиску, вологості, середовища, і т.п.

Більшість представників є мезофілами. Оптимальна температура для них складає 22-28 0С. Оптимальный рН = 6,0-6,8. Можуть розвиватися в інтервалі  рН = 3,5-6,8, тобто серед видів є ацидо- і нейтрофіли.

 При 40 0С затримується ріст, при 50 0С - відмирають клітини, повна загибель при декількох хвилинах  кип’ятіння.

Кандіди не витримують впливу деяких хімічних речовин: розчинів фенолу і формаліну, хлораміну, сульфату міді і цинку, перманганату калію. Ріст  пригнічується багатьма антибіотиками актиноміцетного і грибного походження з різним механізмом дії.

 

3.4 Ріст і розмноження

 

Рід дріжджів Candida - ендосімбіонти тварин-господарів(включаючи людину). Як правило комменсали, але, за деяких умов, певні види(близько 9) можуть викликати хвороби. Живуть всередині іншого організму(хазяїна) і за звичайних умов або приносять йому користь, або ж не приносять ні користі, ні шкоди.

Рід Candida відноситься до бластоміцетів (недосконалих, анаскоспорових, аспорогенних дріжджів), які розвиваються лише в безстатевому стані. Вони розмножуються голобластичним мультилокулярним брунькуванням.

Для дріжджів Candida, як і для інших грибів, відомі явища диморфізму і плеоморфізму.

Міцеліальної-дріжджовий диморфізм проявляється в тому, що один вид може рости у двох формах - одноклітинної і міцеліальних. В тканинах дріжджів роду Candida також можна виявляти як дріжджові клітини, так і гіфи.

Дріжджова фаза представлена овальними або круглыми клітинами-бластоспорами (4-8 мкм), які розмножуються багатостороннім брунькуванням. Оптимальна температура для росту складає 25-28 0С.

У дріжджів Candida голобластичне брунькування - клітинна стінка материнської клітини пом’якшується, вигинається назовні і дає початок клітинній стінці бруньки, до утворення якої залучаються всі шари клітинної стінки материнської клітини. Одночасно кілька бруньок закладається на будь-якому місці клітинної поверхні(множинне брунькування).

Морфогенез дріжджової клітини тісно пов'язаний зі способом вегетативного розмноження. Бластичний тип вегетативного розмноження - це утворення бруньок. Брунька представляє собою виріст на материнській клітині, який при збільшенні в розмірах відшнуровується від неї. На материнській клітині при цьому залишається шрам брунькування, а на бруньці, яка відокремилася - шрам народження. Шрами брунькування, або брунькові рубці, зберігаються на материнській клітині весь період її життя, а шрами народження з часом стають малопомітними.

1 – клітинна стінка, 2 – пазмалема, 3 – первинна септа, 4 – септа  з вторинно відкладеними шарами, 5 – рубець брунькування, 6 – шрам  народження. Рисунок 3.1 – Схема 5 послідовних  стадій голобластичного брунькування  (А-Д)

 

Перехід в міцеліальну фазу можна спостерігати при культивуванні при більш низькій температурі (22-25 0С) або при виснаженні поживного середовища. In vivo перехід дріжджової фази в міцеліальну можна спостерігати при прорастанні в ткани організму.

Міцеліальна фаза представлена ланцюжками подовжених клітин з тришаровою клітинною стінкою, які утворюють псевдоміцелій. Його довжина досягає 12-16 мкм.  На ньому хаотично розташовуються дріжджеподібні бластоспори.

При певних умовах росту материнські та дочірні клітини після брунькування не роз'єднуються, а продовжують брунькуватися. В результаті виникають структури, що імітують міцелій. Такий міцелій називають псевдоміцілієм. На відміну від істинного (септованого) міцелію, в нитках псевдоміцелію між клітинами зазвичай добре помітні перетяжки, а апікальні (кінцеві) клітини завжди коротше попередніх. Псевдоміцелій, що складається тільки з клітин одного типу, схожих за формою та розмірами, називають примітивним (рудиментарним). Складний псевдоміцелій складається з клітин більш ніж одного типу, зазвичай в ньому різко розрізняються довгі клітини, складові псевдогіфа, і розташовані на них та зібрані гронами круглі, овальні або клиновидні бруньки, які в цьому випадку називаються бластоспорами.

Деякі види(C. glabrata) взагалі не формують ні справжнього, ні псевдоміцелію.

 

Рисунок 3.2 – Види брунькування та псевдоміцелію дріжджів роду Candida

 

На рис. 1 зображено види дріжджів роду Candida, які брунькуються(C. glabrata), утворюють простий (C. tropicalis, C. parapsilosis, C. lusitaniae, C. lipolityca) та диференційований (C. krusei, C. kefyr, C. guilliermondii) псевдо міцелій.

Про явище плеоморфізм кажуть, коли в життєвому циклі одного виду існують два або кілька видів безстатевого розмноження. Плеоморфізм у дріжджових грибів роду Candida виражається в тому, що поряд з основним типом вегетативного розмноження - брунькуванням деякі утворюють особливі безстатеві структури, призначені спеціально для поширення або збереження виду:

- ендоспори - вегетативні  клітини. які формуються всередині  клітини або гіфи (рис. 3.3, а; рис. 3.5), їх можна спостерігати в старих культурах дріжджів, вирощених на сусло-агарі, картопляному агарі, солодово-дріжджовому агарі;

- хламідоспори - це великі  сферичні або овальні нестатевого  походження спори, що утворюються  термінально або інтеркалярно  як з поодиноких вегетативних  клітин(в результаті їх округлення), так і на міцелії, по одній або ланцюжками(рис. 3.3, б). Хламідоспори на міцелії утворює, наприклад, C. albicans(рис. 3.4, рис. 3.5), С. tropicalis. Хламідоспори відрізняються потовщеною багатошарової клітинною стінкою і високою концентрацією запасних речовин. Містять багато ліпідів. Біологічна функція таких структур полягає в тривалому збереженні життєздатності в умовах голодування або низької вологості. В середовищах з легкодоступними джерелами енергії такі хламідоспори проростають шляхом брунькування, або утворюють ростові трубки. Для клітин C. albicans властиве утворення «ростової трубки» з бластоспори при поміщенні їх на сироватку(рис. 3.6).

а - ендоспори; б - хламідоспори

Рисунок 3.3 - Деякі способи безстатевого розмноження дріжджів, характерні для роду Candida

 

1 – клітини, які брунькуються, 2 – псевдогіфи, 3 – прохламідоспора,                4 – молода хламідоспора, 5 – зріа хламідоспора, 6 – справдня поперечна перетинка.

Рисунок 3.4 – Культура C. albicans на кукурузному агарі

 

Рисунок 3.5 Мікрофотографія колонії C. albicans

 

Рисунок 3.6 - Утворення «ростової трубки» у C. albicans з бластоспори при поміщенні їх на сироватку

4 ПРЕДСТАВНИКИ РОДУ CANDIDA ТА ЇХ ПРАКТИЧНЕ ВИКОРИСТАННЯ У БІОТЕХНОЛОГІЇ

 

Дріжджі Candida використовуються:

• для виробництва дріжджового білка у якості біомаси як кормова добавка до раціону сільськогосподарських тварин (Candida utilis, C. scottii, C. boidinii і C. tropicalis);
• як харчовий емульгатор (C. utilis);
• для одержання вітамінів рибофлавіну (В2) (C. flaveri, C. guilliermondii), ергостерину (вихідного продукту для одержання вітаміну D2) (C. utilis., C. guilliermondiі, C. tropicalis);
• як джерело одержання ферменту ліпази (C. cylindrica);
• в якості продуцентів органічних кислот (C. fibrae, C. subtropicalis, C. guilliermondii, C. lipolytica, C. oleaophila, C. zeylanoides).
• для перетворення ксилолу на ксиліт (замінник цукру в діабетичних продуктах) (C. utilis);
• для виробництва етанолу (C. pseudotropicalis var. lactose);
• вони відіграють важливу роль в аеробних системах очищення стічних вод(C. guilliermondiі);

- у винобродінні (C. stellata) як дріжджі стартера у виробництві напоїв;

- у молочній промисловості: входять до складу закваски кумису (C. holmii (Torulopsis) - зброджують лактозу).

- біосинтез лимонної кислоти  дріжджами Yarrowia lipolytica.

- використовуються у виробництві біопластику (C. tropicalis)

 

 

 

 

 

 

 

4.1 Отримання рибофлавіну

 

Рибофлавін є коферментом у складі флавопротеїнів (насамперед - відповідних ферментів з класу оксидоредуктаз - ФМН, ФАД). Найбільш привабливими продуцентами є ті штами, які утворюють на  рідких середовищах 0,5 г і більше рибофлавіну в 1 л середовища. Серед представників дріжджів роду Candida широкого застосування набули C. famata і C. guillierniondii.

Дріжджі C. famata (C. flareri) - це осмотолерантні дріжджі, здатні рости при високій концентрації солі, а також здатні до надсинтезу рибофлавіну (вітаміну В2) за умов дефіциту заліза в середовищі. Дріжджі C. famata знаходять своє практичне застосування, адже мутантні штами цього виду, отримані методами класичної селекції, належать до найбільш флавіногенних організмів. Для C. guillierniondii важливо регулювати вміст заліза в поживному середовищі; оптимальні концентрації коливаються, в средньому, від 0,005 до 0,05 мкг/мл. При цьому деякі штами можуть утворювати за 5-7 днів до 0,5 г/л і більше вітаміну.

Під час виробництва вітаміну В2 у якості джерела вуглецю використовують глюкозу або сахарозу, практикують використання дріжджового і кукурудзяного екстрактів, соєвого борошна, олії (жиру). Рідкі поживні середовища для отримання інокуляту і для основної ферментації можуть дещо відрізнятися між собою. Для отримання посівного матеріалу відоме середовище, що містить сахарозу, пептон, кукурудзяний екстракт, калію дигідрофосфат, магнію сульфат, соняшникова олія. Час вирощування продуцента на цьому середовищі - 2 доби при 27-30 0С (в залежності від штаму). Ферментаційне середовище зазвичай включає кукурудзяну та соєву муку, сахарозу, кукурудзяний екстракт, калію дигідрофосфат, кальцію карбонат, натрію хлорид і ненасичений жир.