Біологія вірусу папіломи людини

Самостійне дозвіл бородавок і гострокінцевих кондилом не супроводжується позбавленням від ВПЛ. ДНК вірусу (по крайней мере, в дослідженнях на тварин) можна виявити під зовні звичайному епітелії через місяці і роки після дозволу висипань.

Потужний клітинний  імунітет викликає дозвіл висипань і можна переводить інфекцію в латентну фазу. Тому при звичайному імунітет рецидиви малоймовірні. Навпаки, імунодефіцит (на тлі імуносупресивної терапії або ВІЛ-інфіці) збільшує ризик новоутворень. У цих варіантах хорошим варіантом була б противірусна терапія, дієва щодо ВПЛ.

 Вимоги до  противірусної терапії включають  не тільки дозвіл висипань, але  і відсутність рецидивів мінімум  6-12 міс. Інфекція ВПЛ статевих  органів і перианальной області  проявляється 2-мя хворобами - загостреними кондиломами і дисплазією.

Гострі кондиломи асоціюються  переважно з ВПЛ типу 6 і 11. Гострі кондиломи характеризуються дуже низькому ризиком виникнення злоякісної пухлини. Дисплазію шийки матки по європейській класифікації в залежності від вираженості клітинної атипії ділять на легку, помірну і важку. За класифікацією, прийнятою в США, виділяють дисплазію низькою і найвищого ступеня.

У цьому огляді під важкої дисплазією припускають помірну і важку  дисплазію шийки матки, також  важку дисплазію вульви, заднепроходного  каналу, статевого члена і піхви.

Під легкої дисплазією припускають  легку дисплазію вульви, заднепроходного каналу, статевого члена і піхви. Легка дисплазія асоціюється з ВПЛ як високого, так і невеликого ризику (хоча ВПЛ високого ризику переважає).

Більшість вогнищ ураження при легкій дисплазії підтримують повний цикл розвитку ВПЛ. При всьому цьому експресія вірусних генів вірно регулюється, відбувається експресія пізніх генів і складання вірусів. Принципи лікування гострих кондиломах та легкої дисплазії схожі. Важка дисплазія (по крайней мере, шийки матки) асоціюється з ВПЛ високого ризику.

Через порушення диференціювання  клітин в осередках важкої дисплазії  немає умов для підтримки повного  циклу розвитку ВПЛ. Експресії пізніх генів немає або вона мала. Послідовності  вірусної ДНК вбудовуються в геном  епітеліальних клітин. У результаті клітини починають виробляти онкопротеіни E6 і E7.

Важка дисплазія характеризується хромосомної анеуплоїдій, генетичної нестабільністю і схильністю до озлокачествлению. Генетична нестабільність і зміни  експресії вірусних генів у вогнищах ураження при важкій дисплазії роблять неефективними методи лікування, що застосовуються при легкій дисплазії.

Існує безліч способів лікування хвороб, викликаних ВПЛ. Велика частина з  них орієнтовані не на саму інфекцію ВПЛ, а тільки на її прояви.

 При локальної інфекції ВПЛ  (наприклад, при дисплазії шийки матки) хірургічне лікування здатне видалити вогнище ураження і клітини, схильні до трансформації. При регіонарної інфекції ВПЛ (гострокінцеві кондиломи, дисплазія вульви, дисплазія заднепроходного каналу, дисплазія статевого члена, дисплазія піхви) хірургічне лікування виявляється відсутньою і характеризується найвищим ризиком рецидивів.

2.2 Молекулярні маркери вірусу папіломи людини в ранній діагностиці захворювання

 

За останні десять років з'явилося багато літературних даних про використання ДНК-зондів в якості діагностичного інструменту в клінічних лабораторіях. Оскільки геном кожного мікроорганізму містить унікальні видоспецифічність нуклеотидні послідовності, підібравши до них відповідні зонди, можна ідентифікувати будь-який з патогенів [8, c. 95]. Це дозволяє виявити мікроорганізми, які важко виявити з допомогою культивування, а крім того, призводить до економії часу і коштів, що витрачаються на виділення інфекційних агентів [2, c. 11] .

В основі молекулярних методів  лежить висока специфічність комплементарного спаровування двох молекул ДНК: зонда і мішені (ДНК патогенного мікроорганізму).

Спочатку двухцепочечную молекулу ДНК патогена денатурують нагріванням  або з допомогою хімічних агентів. Потім беруть нуклеїнову кислоту-зонд, комплементарну до специфічної ділянки ДНК (або РНК) мішені, і проводять їх гібридизацію. При цьому зонд попередньо мітять за допомогою радіоактивних ізотопів, ферментів або інших лігандів, наприклад біотину. В результаті комплементарного спаровування зонда і послідовності-мішені утворюються дволанцюжкові дуплекси, які потім детектирують тим чи іншим способом.

Нуклеїнова кислота-мішень може бути фіксована на твердій підкладці, перебувати в розчині, в інтактною клітці або тканини (in situ).

В залежності від типу досліджуваної тканини, що виявляється патогена і характеру зонда застосовують різні способи гібридизації, що забезпечують максимальну чутливість методу і надійність детекції.

Зонди для виявлення патогенних організмів можуть мати різне походження, але в будь-якому випадку вони повинні бути специфічні щодо генетичного матеріалу тих мікроорганізмів, які передбачається виявити. Для цього - в залежності від поставленого завдання - створюють видоспецифічність зонди або зонди, комплементарні унікальним послідовностей в геномі даного патогена. Зонд може являти собою відносно протяжний ділянку (102-104 п. н.)

Геномної ДНК, отриманий клонуванням  фрагментів геному патогенного організму. Протяжні зонди для одноланцюгових нуклеїнових кислот можна отримати за допомогою транскрипції in vitro, в результаті якої утворюються високоспецифічні РНК-зонди.

У клінічних лабораторіях широко використовують синтетичні оліго-зонди довжиною 12-100 нуклеотидів, які синтезують хімічним шляхом, використовуючи в якості матриці одноланцюжкові ДНК. Часто такі зонди, призначені для виявлення специфічних патогенів, можна придбати на фірмах. Гібридизація з короткими олігонуклеотидних зондами більш специфічна, ніж з протяжними, і здійснюється швидше, проте її чутливість нижче, оскільки в короткий зонд можна включити не так багато молекул-свідків (міток). Чутливість гібридизації з олігонуклеотидних зондами дозволяють істотно підвищити системи ампліфікації [4, c. 56].

Отже, при виборі зондів слід враховувати  кілька факторів: наявність готових препаратів або можливість синтезу олігонуклеотидних зондів самостійно, чутливість та специфічність детекції, тип молекул-свідків, умови гібридизації.

Молекулярно-біологічні методи - реакція  гібридизації in situ, ПЛР, ДНК - зонд. В  даний час велике значення надається застосуванню молекулярно-біологічних методів з метою докази наявності ВПЛ і його типування. В основному використовують два основних тесту: ПЛР і метод Hybrid Capture, який називають "Digene-тест", що вказує на назву розробника. Застосування цих тестів дозволяє визначити більш ніж 70 різних типів ВПЛ, типувати за ступенем онкогенності, що найбільш важливо при 16 і 18 типах.

Важливість виявлення ДНК ВПЛ  і типування вірусу обумовлена тим, що у 15-28% жінок з наявністю ДНК  ВПЛ (при нормальній цитології) протягом 2 років розвивається сквамозна інтраепітальная неоплазія, а у жінок з відсутністю ДНК ВПЛ захворювання розвивається лише в 1-3% випадків.

Цитологічна діагностика повинна  бути доповняться проведенням ПЛР, що дозволяє визначити наявність онкогенних типів ВПЛ. Методом ПЛР віруси ідентифікуються задовго до появи перших цитологічних, і тим більше - клінічних ознак захворювання.  

Існують три основні категорії  лабораторних методів визначення ДНК  ВПЛ: неампліфікаціонние, ампліфікаціонних та сигнальні ампліфікаціонних.

У комплексі з цитологічним дослідженням, визначення інфекції з використанням  ВПЛ Digene-тесту досягає 95% виявлення  ЦІН-1 і ЦІН-2, що може служити ефективним доповненням до цервікальної цитології  і може допомогти знизити захворюваність і смертність від цервікального раку. Чутливість Digene-Тест становить 95%, при цьому його прогностична цінність доходить до 99%.

ВПЛ Digene-Тест - являє собою дослідження, яке має найвищу на сьогоднішній день чутливістю. Дане дослідження  дозволяє виявити тип папіломавірусу і його приналежність до високоонкогенні або низькоонкогенних групі, а також визначити клінічно значимі концентрації вірусу в тканинах.

Для проведення дослідження ВПЛ Digene-Тест можливо використовувати різний матеріал: зішкріб епітеліальних клітин, отриманий з цервікального каналу, піхви, уретри; предметне скло з наявним матеріалом для цитологічного дослідження; тканини, отримані в результаті біопсії.  

Визнання комбінування двох методик  ВПЛ Digene-Тесту з цитологічним дослідженням "золотим стандартом" в діагностиці ВПЛ ураження шийки матки, з'явилося завдяки можливості контролю концентрації вірусу папіломи в організмі. Таким чином, можна зробити прогноз про варіанти розвитку хвороби. 

Єдиний підхід до систематизації проведення ВПЛ Digene-Тест дозволяє запобігти процесу розвитку неоплазії.

Комбінована методика на основі Digene-Тест рекомендується для скринінгових досліджень у жінок молодше 30 років, якщо ВПЛ Digene-Тест позитивний і при цьому відсутні ознаки ПВІ, то необхідно провести повторне дослідження через 1 рік у жінок старше 30 років якщо тест негативний, то рекомендується його повторне проведення через 1-3 роки у жінок старше 30 років, якщо тест позитивний, це вказує на персистенції вірусу, присутність зміни при кольпоскопії та цитологічному дослідженні свідчить про можливе високому ризику розвитку раку шийки матки.

2.3 Значення інтеграції ДНК-вірусу папіломи людини в геном господаря для онкогенної трансформації клітин

 

ВПЛ інфікує епітеліальні тканини, що підтверджується наявністю епісомального вірусного геному в клітинах базального шару епітелію. Життєвий цикл вірусу тісно пов'язаний з диференціацією клітини-господаря. Реплікація вірусної ДНК і синтез капсидних білків відбуваються в найбільш диференційованих шарах епітелію. Вірус має цілий набір механізмів, які підпорядковують своїм інтересам життєдіяльність інфікованої клітини. ДНК вірусу кодує синтез двох білків Е6 і Е7, які сприяють переходу диференційованих клітин в S-фазу клітинного циклу.

На стадії активної репродукції  вірусу експресія генів Е6 і Е7 регулюється продуктом гену Е2, який являється репресором транскрипції цих генів. Саме тому, до того часу доки вірус знаходиться в епісомальному стані, спостерігаються доброякісні процеси розростання інфікованих тканин. Ключовою подією в малігнізації клітин є інтеграція вірусу до геному клітин, яка супроводжується делецією гену Е2 [25, c. 5].

Ця подія має два важливих наслідки:

1) в епітеліальних клітинах з  інтегрованою формою ВПЛ реєструється  надекспресія генів Е6 і Е7, так як в процесі інтеграції втрачається ген Е2, який кодує репресор транскрипції цих генів;

2) будь-які антивірусні препарати  безсилі зупинити процес пухлинної  трансформації, так як інфіковані  клітини не містять вірус у  традиційному розумінні, і всі  лікувальні заходи мають бути направлені на елімінацію клітин з інтегрованою формою геному ВПЛ.

Контроль клітинного циклу та диференціація  клітин здійснюються білками Е6 та Е7 через їх взаємодію та інактивацію  таких "ключових" білків-регуляторів  проліферативної активності клітин, як р53 і білок ретинобластоми (рRB). Безконтрольна проліферація інфікованих клітин призводить до накопичення генетичних пошкоджень і, в кінцевому результаті, до малігнізації.

Онкобілок Е7 використовує декілька шляхів для регуляції клітинного циклу. Він може утворювати стабільний комплекс з білком  рRB, викликаючи його деградацію, що призводить до вивільнення транскрипційного фактора Е2F, який стимулює транскрипцію генів, необхідних для реплікації ДНК і  S-фази клітинного циклу. Е7  впливає на активність цілого ряду білків клітинного циклу, такі як А та Е цикліни, cdk2 кіназу та інгібітори циклінзалежної кінази р21 і р27 ІІ.

Роль клітинного білка р53 в етіології РШМ. Білок р53 локалізується в клітинному ядрі, має молекулярну масу 53 кД і складається із 393 амінокислот.

Одним з найбільш значних властивостей білка, які визначають підвищену  цікавість до нього, являється його можливість контролювати проліферативну активність клітин. У 1991 році було встановлено, що білок, виділений з пухлинних  клітин, відрізняється від свого нормального гомолога наявністю мутацій.

Детальне вивчення структурно-функціональних властивостей білка дозволило встановити, що він являється інгібітором  клітинних протеінкіназ, здійснюючи таким чином контроль над клітинним  циклом. Мутантна форма білка втрачає цю властивість, внаслідок чого виникає пухлинна трансформація. Той факт, що всі пухлини містять мутантний варіант р53, дозволив віднести цей білок, а саме його нормальний гомолог, до супресорів пухлинного росту.

Встановлено, що онкобілок Е6, який кодується вірусами ВПЛ-18 і ВПЛ-16, може взаємодіяти з білком р53, викликаючи його деградацію.

Є дослідження, що гіперестрогенія  сприяє розвитку РШМ, а прогестини блокують фазу ініціації пухлини.

Розглянемо роль гормональних факторів у розвитку РШМ.

 Добре відома роль естрогенів  у розвитку неопластичних процесів  в, так званих, естроген-чутливих  тканинах. До числа останніх відносяться  тканини молочної залози, ендометрію  та шийки матки, а також епітелію  гортані. Естрадіол - один  з найбільш активних жіночих статевих гормонів - має високу спорідненість з естрогеновими рецепторами і, взаємодіючи з ними, здійснює суттєвий вплив на метаболічну та проліферативну активність клітин.