Биотехнология ферментов

В составе Амилоризина П10Х содержится комплекс ферментов амилолитического и протеолитического действия, наибольшее значение из которых имеет &-амилаза. Продуцентом Амилоризина П10Х является плесневой гриб Aspergillus oryzae. Оптимальные условия действия Амилоризина ШОХ-рН 4,7-5,4 и температура 40-45°С.

Амилосубтилин Г10Х представляет собой очищенный ферментный препарат, образуемый Bacillus subtilis. Препарат содержит &-амилазу, (3-глюканазу и протеазу. Оптимальными условиями действия препарата являются рН 6,0-6,3 и температура 50-55°С. Бактериальная ?-амилаза по сравнению с грибной обладает высокой термостабильностью, температура инактивации составляет 63-71°С.

Амилоризин П10Х и Амилосубтилин Г10Х оказывают наиболее эффективное действие при добавлении к муке с упругой, недостаточно эластичной клейковиной, с пониженной и нормальной сахарообразующей способностью (180—250 мг мальтозы на 10 г муки) и автолитической активностью до 30%.

Глюкоамилаза очищенная (оптимальные условия действия: рН 3,0-5,0; температура 55-60°С) — препарат, продуцентом которого являются гриб Aspergollus awamory или штамм дрожжей Endomycopsiz sp. 20-9, находит применение при производстве высокоосахаренных ферментативных полуфабрикатов и жидких дрожжей.

Значительным недостатком  применения амилолитических препаратов является наличие в их составе протеазы, что затрудняет их использование при переработке муки с пониженным содержанием клейковины, а также слабой по силе. Хлебные изделия лучшего качества получаются при совместном внесении амилолитических ферментов и улучшителей окислительного действия.

Отечественный цитолитический ферментный препарат, продуцентом которого является культура гриба Trichothecium rozeum, обладает гемицеллюлазной, целлобиазной, пентозаназной активностью. В результате исследований по поиску возможностей использования в хлебопекарной промышленности Цитороземина П10Х, который отличается высокой цитолитической и незначительной амиполитической и протеолитической активностью, было сделано следующее заключение: добавление его в тесто в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1% к массе муки способствует дополнительному обогащению теста редуцирующими сахарами, приводит к значительному накоплению в нем водорастворимых пентозанов, изменению упруго-пластических свойств клейковины, способствует улучшению реологических свойств геста, что приводит к увеличению объемного выхода хлеба.

Зарубежные аналоги ферментных препаратов

 
Зарубежными фирмами, также выпускаются  ферментные препараты, обладающие амилолитической активностью.

К ним относятся: Fungamyl BG (Фунгамил BG), приготовленный на основе очищенной грибной амилазы (оптимум рН 4,5-5,0 температуры 53-55°С), Bioferm P, Biobake P conc, Grindamyl A 1000, характеризующиеся низким уровнем амилоглюкозидазной и протеиназной активности, что позволяет применять их при переработке муки с различными хлебопекарными свойствами.

Gungamyl Super AX, Biobake 721 и Grindarmyl100 разработаны для коррекции низкой амилолитической активности муки, а также для улучшения структуры мякиша, повышения объема хлебобулочных изделий и продления срока сохранения свежести.

Препараты Novamyl, Biobake 2000, Grindamyl MAX-LIFE U4 и Grindamyl MAX-LIFE Е5 предназначены для удлинения срока хранения хлеба в свежем состоянии. Ферментный препарат Novamyl проявляет максимальную активность при выпечке тестовых заготовок (оптимумы рН 5,8-6,0, температуры 54-76°С) и способствует более полному протеканию процесса клейстеризации крахмала, что приводит к значительному увеличению срока свежести хлеба.

Grindamyl MAX-LIFE U4 - ферментный комплекс, состоящий из грибной и бактериальной амилаз, разработанный для замедления черствения хлебных изделий, вырабатываемых опарными способами, Кроме того, добавление ферментного препарата Grindamyl MAX-LIFE U4 приводит к улучшению показателя стабильности теста. Препарат Grindamyl MAX-LIFE E5 грибного происхождения целесообразно применять при ускоренных технологиях.

Ферментные препараты  с гемицеллюлазной активностью действуют на нерастворимые высокомолекулярные пентозаны, содержащиеся в пшеничном тесте, увеличивают долю низкомолекулярных пентозанов, что способствует образованию более прочного клейковинного каркаса. Внесение препаратов с гемицеллюлазной активностью способствует увеличению доли связанной влаги в тесте. Это приводит к увеличению водопотлотительной способности полуфабрикатов и, следовательно, к улучшению структурно-механических свойств теста.

Из зарубежных ферментных препаратов с гемицеллюлазной активностью применяют препарат Pentopan 500 BG (Пентопан 500 BG), представляющий очищенный препарат фермента, полученного при культивировании Humicola insolens и проявляющего пентозаназную активность (оптимальные условия рН 5—6 и 4°С). Применение этого препарата способствует стабилизации свойств теста, увеличению объема хлеба, улучшению структуры мякиша, продлению срока сохранения свежести готовых изделий.

Протеолитические ферментные препараты, катализирующие гидролитическое  расщепление белковых веществ, целесообразно  использовать при переработке муки с чрезмерно сильной клейковиной, так как ферменты этой группы, проявляя восстановительную активность, оказывают  деструктурирующее действие на клейковину муки и улучшают реологические свойства теста. Крове того, ферментные препараты  этой группы применяют при производстве затяжного печенья, крекеров, слоеных  изделий из бездрожжевого теста.К протеолитическим ферментным препаратам относятся Прото-субтилин Г10Х или Г20Х, продуцентом которого является Bacillus subtilis, а также Протозим, Neutease (Novo Noelisk).

Ферментные препараты, обладающие липолитической активностью, в качестве основного фермента содержат активную липазу. Фермент липаза осуществляет гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. В качестве препарата с липолитической активностью применяют Новозим 677 BG (Novo Noelisk). Применение этого препарата позволяет увеличивать стабильность теста и объем хлеба, улучшать структуру пористости и цвет мякиша.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Технические препараты  ферментов.

Комплексный амилолитический ферментный препарат получают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого “грибного солода” с последующим выпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделить из культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим высушиванием коагулятом при температуре 27-270С. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 400 С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулят сушат вместе с наполнителем.

Комплекс ферментов протеолитического  и амилолитического действия получают при помощи культуры Bacillus subtilis. Это аэробные, грамположительные, подвижные палочки. Для этих бактерий характерен очень богатый комплекс гидролитических ферментов. В качестве источников питания они могут использовать белки, углеводы, спирты, органические кислоты. Bacillus subtilis культивируют как методом поверхностного культивирования на отрубях, так и в жидких средах особого состава по методу глубинного культивирования.

Целлюлолитические ферментные препараты. Производство целлюлаз основывается на использовании культуры гриба Trichoderma viride. Существующие в настоящее время способы получения целлюлаз в глубинной культуре предполагает выращивание микроорганизмов-продуцентов целлюлаз на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода, как правило, очищенную целлюлозу, или же содержащие ее природные субстраты. Но получение целлюлазы с использованием в качестве основного компонента среды природной целлюлозы (например, древесные опилки) сопряжено с рядом технологических трудностей. Более рационально использование питательной среды, содержащей растворимый “индуктор”. Такой питательной средой может быть молочная сыворотка, основным компонентом которой является лактоза (предварительно от молочной сыворотки отделяют белок). В качестве продуцента может быть использован гриб Trichoderma lignorum, позволяющий получить весь комплекс целлюлолитических ферментов, необходимый для расщепления природных целлюлозусодержащих субстратов.

 

Общие методы определения активности ферментов.

Прежде чем преступить к выделению фермента, необходимо избрать и тщательно отработать метод определения активности, под  контролем которого производится выбор  наиболее эффективных приемов очистки  ферментов, а затем и выполнение последовательных стадий его препаративного получения. Активность фермента меняется при различных условиях реакции и зависит от температуры, рН среды, от концентраций субстратов и кофакторов. Учитывая это, при определении активности фермента на разных стадиях очистки необходимо строго соблюдать одни и те же условия. Желательно не ограничиваться определением активности по одному какому-либо методу. Количество субстрата, превращаемого в условиях теста по определению активности фермента, должно быть пропорционально количеству последнего и времени инкубирования. Если же нет такой пропорциональности, то активность рассчитывают по предварительно построенному калибровочному графику, отражающему зависимость скорости реакции от количества единиц фермента. Когда ход реакции нелинеен во времени, следует определять начальную скорость реакции (по тангенсу угла наклона касательной к начальному отрезку кривой превращения). Для этого легче всего применять такие методы изменения активности, которые позволяют непрерывно следить за ходом превращения во времени: спектрофотометрические методы, потенциометрические, полярографические и т.п. Для измерения скорости ферментативной реакции необходимо выбрать буфер, который не тормозит исследуемую активность и обеспечивает поддержание рН раствора, близкой к оптимальной для данного фермента. Реакцию проводят при температуре, лежащей в большинстве случаев в пределах 25-400С. При исследовании ферментов, требующих присутствия кофакторов (ионов металлов, коферментов и др.), концентрация которых может снижаться по мере очистки фермента, в реакционную смесь следует добавлять недостающие кофакторы, например соли металлов, АТФ, НАДФ и т.п. Также для определения активности ферментов вводят стабилизаторы в состав опытных смесей. Во многих случаях добавление желатина, альбумина и других добавок предотвращает денатурацию ферментного белка.

Спектрофотометрические  методы. Спектрофотометрические методы основаны на поглощении света в определенных участках спектра многими соединениями, являющимися активными группами ферментов, субстратами или продуктами реакции. Положение максимума поглощения при определенной длине волны  определяется наличием в исследуемом  материале определенных групп - аналитических форм. Для измерения спектров используют специальные приборы - спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры и др. Этот метод отличается высокой чувствительностью, быстротой определения, малым расходованием фермента и реактивов и позволяет следить за течением реакции во времени. Для этого реакционную смесь помещают в кювету, вставленную в термостатируемый кюветодержатель. Через малый промежуток времени после добавления фермента (или субстрата) и быстрого перемешивания измеряют поглощение при длине волны, характерной для используемого субстрата или конечного продукта, образующегося в данной реакции. С помощью спектрофотометрического метода можно измерять непосредственно концентрацию некоторых ферментов (после достаточной очистки) по величине характерных максимумов поглощения прочно связанных коферментов (простетических групп). Необходимо иметь произвольно выбранную единицу фермента, с помощью которой можно было бы количественно выразить чистоту и активность различных фракций. В большинстве случаев выбор единицы зависит от избираемого метода определения. В случае спектрофотометрического метода такой единицей может служить количество фермента, которое вызывает определенное изменение в оптической плотности за определенное время при данных условиях опыта; если определяется продукт реакции, то единицей будет количество фермента, которое вызывает образование определенного количества вещества в минуту, и т.д. Тогда удельную активность фермента, которая является мерилом чистоты ферментного препарата, выражают числом единиц в 1 мг вещества (белка).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы

 
1. Бирюков, В.В. Основы промышленной  биотехнологии / В.В. Бирюков. –  М. Колос, 2004.

2. Варфоломеев С.Д., Гуревич  К.Г. Биокинетика: практический курс. - М.: ФАЙР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

3. Грачева И.М., Кривова  А.Ю. Технология ферментных препаратов. – 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.

4. Грачева, И.М. Технология  ферментных препаратов / И.М. Грачева.  – М.: Агропромиздат, 1985.

5. Манаков, М.Н. Теоретические основы промышленной биотехнологии / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимский. – М.: Высшая школа, 1989. – 310 с. 

 

6. Биотехнология, в 8-ми томах // Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. – М.: "Высшая школа", 2005.

7. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. – М.: 1999.

8. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. – СПБ: "Наука", 2005.

9. Сельскохозяйственная биотехнология. Учебное пособие // Под ред. В.С. Шевелуха. – М.: «Высшая школа», 2003.