Биотехнология ферментов

Введение

В современной биотехнологии  одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы  при хранении, а также чувствительны  к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении  их от реагентов и продуктов реакции.

Одним из важных направлений  современной биотехнологии является получение на основе культивирования  микроорганизмов и использование  в сельском хозяйстве различных  ферментных препаратов, которые могут  применяться в процессе приготовления  кормов для сельскохозяйственных животных как добавки к кормам для улучшения  их усвояемости, а также в ветеринарии  для профилактики и лечения желудочных и паразитарных заболеваний. Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов  для всего живого на Земле послужило  основой для становления и  развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного  производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно  изменить, интенсифицировать и усовершенствовать  многие существующие технологии или  даже создать принципиально новые  высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, фналадить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

Большим и неоспоримым  достоинством ферментов перед химическими  катализаторами является то, что они  действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определенные соединения. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и расширяться.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Биотехнология ферментов

Ферменты (энзимы) (от лат. fermentum - закваска) - это белки, выполняющие роль катализаторов в живых организмах. Основные функции ферментов - ускорять превращение веществ, поступающих в организм и образующихся при метаболизме (для обновления клеточных структур, для обеспечения его энергией и др.), а также регулировать биохимические процессы (напр., реализацию генетической информации), в т.ч. в ответ на изменяющиеся условия.

Выделяют 6 основных классов  ферментов:

I класс – Оксидоредуктазы

II класс – Трансферазы

III класс – Гидролазы

IV класс – Лиазы

V класс – Изомеразы

VI класс – Лигазы

Достоинства ферментов по сравнению с неорганическими катализаторами:

- нетоксичность,

- работают в мягких  условиях, не требующих высоких  температур и, следовательно,  затрат топлива,

- используют доступное  сырье (часто отходы), что выгодно  с экономической и экологической  точек зрения.

Ферменты по объёму производства занимают 3 место после аминокислот  и антибиотиков.

Известно и охарактеризовано примерно 2000 ферментов по данным энзимологии. В промышленности используется всего  около 30 ферментов. Из производимых ферментов  чаще всего используются (и продаются) гидролазы – щелочные и нейтральные  протеазы (60%). Они в основном используюся в качестве детергентов при производстве синтетических моющих средств. На втором месте - гликозидазы (30%). Они используются в производстве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Основное место среди них занимают глюкоизомераза и глюкозамилаза, применяющиеся при обогащении фруктозой кукурузных сиропов и составляющие около 50% рынка пищевых ферментных препаратов.

Применение  ферментов в технологических процессах:

- амилаза – гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы в спиртовой и пивоваренной промышленности, хлебопечении, получении патоки, глюкозы,

- липазы – гидролиз жиров и масел в пищевой, медицинской промышленности, сельском, жилищно-коммунальном хозяйстве, бытовой химии,

- пектиназа – гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков,

- глюкоизомераза – изомеризация глюкозы во фруктозу в кондитерской, ликероводочной, безалкогольной промышленности, хлебопечении. Фруктоза является более сладким моносахаридом, чем глюкоза.

- пептидогидролаза – лизиса (гидролиза) белков в получении аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, выделка кож, активизация пищеварения. В пивоваренной, винодельческой, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве, медицине.

- целлюлазы – гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратнная промышленность. Хлебопечение, коромопроизводство.

- фруктофуранозилаза – инверсия сахарозы. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, производство сиропов.

 

 

 

 

Получение ферментов

Традиционные источники  ферментов – это природные  объекты, в которых содержание фермента составляет не менее 1%.

Без применения биотехнологии  для получения ферментов в  больших количествах пригодны только некоторые растительные организмы  на определенной фазе их развития: например, проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой  массы некоторых растений, а также  ткани и органы животных: сычуг  крупного рогатого скота, семенники  половозрелых животных.

Зато практически неограниченный источник ферментов – это микроорганизмы и грибки. За счёт размножения они  самостоятельно наращивают объёмы производства ферментов.

В настоящее время наиболее прогрессивным является метод культивирования  микроорганизмов при непрерывной  подаче в ферментер как питательной среды, так и посевного (микробного) материала.

Иммобилизованные  ферменты

Иммобилизированные ферменты (от лат. immobiiis — неподвижный) - это препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), и сохраняют при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов.

Существует несколько  основных способов иммобилизации ферментов.

Способы иммобилизации  ферментов:

1) путем образования ковалентных  связей между ферментом и матрицей;

2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствии  фермента, который при этом оказывается  включенным в сетку полимера - обычно геля;

3) благодаря электростатическому  взаимодействию противоположно  заряженных групп фермента и  матрицы;

4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;

5) связыванием фермента  и матрицы в результате невалентных взаимодействий - гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;

6) инкапсулированием - созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, например, включением фермента в липосомы;

7) сшиванием молекул фермента  между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты.

Конкретные примеры использования  иммобилизированных ферментов: производство фруктозы из глюкозных сиропов.

Иммобилизованные ферменты в промышленности

Сегодня в промышленности реализовано  всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов:

1. Глюкозоизомеразы.

2. Аминоацилазы.

3. Пенициллинацилазы.

4. Лактазы. Так, лактазу иммобилизовали на частицах кремнезема и применяют для превращения лактозы молочной сыворотки в глюкозу и галактозу.

Перспективные ферменты

В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для  следующих целей.

1. Холинэстераза. Она может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.

2. Карбоангидраза. Аналогичным образом другие ферменты могут использоваться для определения токсических веществ. Так, карбоангидраза очень чувствительна даже к малым концентрациям хлорпроизводных углеводородов,

3. Гексокиназа — чувствительна к хлордану, линдану и токсафену.

4. Диизопропилфторфосфатаза.Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфоорганических нервных газов (зомана, зарина).

5. Гепариназа. Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения.

6. Билирубиноксидаза. Иммобилизованная билирубиноксидаза может использоваться для удаления билирубина из крови новорожденных, страдающих желтухой.

7. Гемоглобин. Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Суть его состоит в том, что включенный в полиуретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%. Затем кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда или в вакууме. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.

Следующий этап в применении иммобилизованных ферментов - это создание систем сразу  из нескольких иммобилизованных ферментов, подобно тому, как это делается в живой клетке.

Иммобилизованные ферменты найдут дальнейшее применение в молочной промышленности. При производстве сыра могут использоваться иммобилизованные свертывающие молоко белки — реннин и пепсин. Для гидролиза жира в молоке можно использовать иммобилизованные липазы и эстеразы. Получим "биотехнологический" сыр.

Разнообразные иммобилизованные ферменты со временем найдут применение и в  датчиках для быстрого анализа. Сегодня  в таком качестве используются лишь несколько ферментов, но когда будет  решена проблема стабилизации, их число  увеличится. Особенно полезными из-за их высокой стабильности могут оказаться ферменты термофилов.

Применение иммобилизованных ферментов позволило решить задачу создания крупных промышленных биокаталитических процессов, с помощью которых производят аминокислоты, органические кислоты сахара, органические растворители, метан, антибиотики, гормональные препараты, производят очистку сточных вод и водоемов, биоконверсию органических отходов.

Номенклатура ферментов, имеющих значение в пищевой промышленности

Шифр	Систематическое название	Тривиальное название
Оксидоредуктазы
1.1.3.4 1.11.1.6    1.14.18.1	β-D-глюкоза: О2-оксидоредуктаза     Н2О2: Н2О2-оксидоредуктаза    Монофенол, дигидрооксифенилаланин: О2-оксидоредуктаза	Глюкозооксидаза    Каталаза    Монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, тирозиназа, фенолаза
Гидролазы
3.1.1.3.    3.1.1.11 3.2.1.1 3.2.1.2 3.2.1.3 3.2.1.4 3.2.1.15    3.2.1.20 3.2.1.21 3.2.1.23 3.4.23.1 3.4.23.4 3.4.21.4 3.4.21.1 3.4.22.5 3.4.21.1 3.4.21.6 3.4.22.6 3.4.22.3 3.4.22.14 3.4.23.6 3.4.24.3	Триацилглицерол – ацилгидролаза     Пектин – пектилгидролаза 1,4-α-D-глюкан глюканогидролаза 1,4-α-D-глюкан мальтогидролаза 1,4-α-D-глюкан глюкогидролаза 1,4-β-D-глюкан-4-глюкангидролаза Поли-α-1,4-галактуронид-гликаногидролаза α-D-глюкозид глюкогидролаза D-глюкозид глюкогидролаза β-D-глюкозид галактогидролаза – – – – – – – – – – – –	Липаза, триацилглицероллипаза Пектинэстераза α-амилаза β-амилаза γ-амилаза, глюкоамилаза Целлюлаза Полигалактуроназа    α-гликозидаза β-гликозидаза Лактаза, β-галактозидаза Пепсин Химозин (реннин) Трипсин Химотрипсин Эластаза Папаин Химопапаин Фицин Бромелаин Субтилизин Кислая протеиназа Коллагеназа
Изомеразы
5.3.1.9	D-глюкозо-6-фосфат-кетоизомераза	Глюкозоизомераза, глюкозофосфат-изомераза