Биотехнология антибиотиков

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Методы анализа антибиотиков.

   В отличие от некоторых других природных соединений (алкалоиды, гликозиды) для антибиотиков не существует общих групповых реакций. Такие реакции могут быть использованы только для антибиотиков одного химического класса, например для тетрациклинов или нит-рофенилалкиламинов (левомицетинов).

   Для идентификации антибиотиков могут быть использованы различные цветные реакции на соответствующие функциональные группы; спектральные характеристики в видимой, УФ- и ИК-областях спектра; хроматографические методы.

   Для количественного определения антибиотиков используют биологические, химические, физико-химические методы.

    Биологические методы основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на применяемый тест-организм, чувствительный к данному антибиотику. Применяемый при этом диффузионный метод основан на способности молекул антибиотиков диффундировать в агаровых средах. Оценивается размер зоны, в которой используемые тест-организмы не развиваются. Этот размер зависит от химической природы антибиотика, его концентрации, рН и состава среды, температуры эксперимента.

    В основе другой разновидности биологического тестирования лежит турби-диметрия - метод количественного анализа по интенсивности света, поглощенного взвешенными частицами - клетками микроорганизмов. При добавлении определенных количеств антибиотиков наблюдается задержка роста клеток микроорганизмов (бактериостатический эффект), а затем их гибель (бактерицидный эффект). При этом изменяется (уменьшается) интенсивность поглощенного света. В качестве альтернативного турбидиметрии метода может быть использован нефелометрический метод количественного анализа по интенсивности света, рассеянного микроорганизмами.

    Для количественного определения антибиотиков применяют различные спектральные методы - в первую очередь, фотоколориметрический и спект-рофотометрические методы. Например, для определения концентрации раствора эритромицина можно применить фотоколориметрический метод, основанный на изменении абсорбции раствора антибиотика после взаимодействия его с серной кислотой. Антибиотики тетрациклинового ряда могут быть определены спектрофотометрическим методом по полосе поглощения, исчезающей после щелочного гидролиза действующего вещества.

    Разработан способ, сочетающий физико-химический и биологический подходы к оценке активности ЛС. Метод основан на лазерной дифракции в среде, содержащей клетки микроорганизмов при действии на них химических веществ, в частности антибиотиков

 

Сохранение штаммов продуцентов антибиотиков в активном состоянии

  

    Важное значение для промышленного получения антибиотиков, а также для лабораторных исследований продуцентов антибиотических веществ имеют методы поддержания жизнеспособности организмов, позволяющие сохранить их антибиотическую активность на постоянном уровне.

    Известно, что микроорганизмы и в особенности актиномицеты легко изменяются при обычных методах их хранения. Причём довольно часто при этом наблюдается полная или частичная потеря антибиотических свойств.

Потеря антибиотических свойств зависит, по-видимому, от того, что мы не умеем в обычных условиях культивирования создать такие условия, которые бы способствовали сохранению организмом его основных физиологических особенностей. Нередко потеря активности наблюдается при культивировании микроорганизмов на богатых по составу средах и при частых пересевах.

Вместе с тем изменение физиологических или биохимических свойств продуцентов антибиотических веществ может определяться, их генетическими закономерностями. Известно, например, что продуцент грамицидина С в процессе развития диссоциирует на ряд вариантов, некоторые из которых не образуют этот антибиотик. Причем процесс диссоциации культуры идет в направлении образования в большом количестве биологически неактивных вариантов, что в конечном итоге приводит к полной потере культурой способности образования грамицидина.

    В настоящее время используется ряд методов сохранения культур продуцентов антибиотиков, обеспечивающий их длительное пребывание в активном состоянии. В основу этих методов положен принцип задержки развития микроорганизмов, принцип консервации. Для каждого вида продуцента антибиотических веществ должен быть подобран свой, наиболее подходящий метод консервирования, позволяющий сохранить культуры в активном состоянии в течение относительно длительного времени.

    Наиболее распространенными методами сохранения культур микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в активном состоянии являются следующие.

1. Лиофилизация культур.
2. Хранение вегетативных клеток или спор организмов в стерильной почве, стерильном песке или на семенах некоторых растений (например, просе). По данным ряда авторов, культуры актиномицетов, находящихся в стерильной почве, сохраняют жизнеспособность в течение 30 лет и более.
3. Хранение спор в виде водных суспензий в запаянных ампулах.

     4. Хранение спор в стерильном кварцевом песке.

     5. Хранение культур на агаровом косячке под минеральным маслом.

     6. Хранение культур при низких температурах (+4, +5°С).

 

    В последнее время для сохранения различных микроорганизмов в активном состоянии используют жидкий азот, в который помешают отмытую от среды суспензию клеток. Иногда в газообразной фазе жидкого азота сохраняют культуры актиномицетов, находящиеся на агаровых оболочках, вырезанных из агаровой пластинки в чашках Петри.

    Наилучшей формой сохранения организмов, при которой не наблюдается потери антибиотической активности, является их лиофилизация - метод пригоден как для спорообразующих, так и для бесспоровых культур микроорганизмов. Сущность этого метода состоит в том, что суспензия клеток или спор микроорганизма, приготовленная на среде, богатой белками (часто используется для этих целей кровяная сыворотка), быстро замораживается при температуре от - 40 до - 60°С и высушивается под вакуумом до остаточной влажности (0,5-0,7%). После такой обработки ампулы со спорами или клетками лиофилизированного микроба запаивают. Лиофилизированные формы бактерий могут сохраняться в течение 16-18 лет, споры грибов не теряют основных свойств при хранении их в лиофилизированном виде в течение 10 лет.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

 
1. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Пищевая пром-сть, 1975. - 392

2. Журавский Г.И., Новоселова Л.В., Елисеев М.И. и др. Производство пищевых кислот. - М., 1953.

 

3. Котова В.В., Гошев В.Е. Производство и применение ферментных препаратов за рубежом. - М., 1973. - 86 с.

4.Кузнецов В.Д. Микроорганизмы продуценты антибиотиков. - В кв.: Производство антибиотиков.- М., 1970. - 361 с.

5.Лосякова Л.С., Рудевко Т.П. и др. Изучение уоловий биосинтезе пектолитических ферментов плесневых грибов Aspergillus foetidue. - Тр. ВНИИсинтезбелок, 1972, вып. I, 0.88-93.

6. Лука В.Т., Карклинь Р.Я., Пробок А.К., Зитола Г.А. Биосин-5.J8 итаконовой кислоты из двойного соединения глюкозы с хлористым натрием. В кн.: Культивирование микроорганизмов. - Рига: Зинатне, 1969, с.157-164,

7. Межиня Г.Р. Чашечный метод определения L-лизина. - Изв. АН ЛатвСССР, 1967, № I, с.80-83.

8. Мушникова Л.Н., Лосякова Л.С, Яровнеко В.Л. Образование пектолитических ферментов плесневым грибом Aspergillus awamori-16 при культивировании на твердых питательных средах. - Микробиологический синтез, 1968.

9. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.- М.: Мир, 1978. 331

10. Работнова И.Л. Проблема культивироввния микроорганизмов. Микробиология, 1977, т. 46, вып. 5, с. 796-810.

11. Тимаков В.Д. Некоторые методологические вопросы проблемы изменчивости и последовательности микроорганизмов. - Вестник АМН, 1959.

12. Фатеев М.В. Методы хранения коллекционных культур дрожжей. - В кв.: Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. - М.: Наука, 1967.