Биотехнология антибиотиков

 

Полусинтетические антибиотики.

    Их готовят комбинированным способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного изменения химической структуры - полусинтетические препараты.

    Большим достижением является разработка метода получения полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было извлечено ядро молекулы пенициллина - 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем присоединения к молекуле 6-АПК бензильной группы создан бензилпенициллин, который теперь получают и методом биологического синтеза. Широко применяемый в медицине под названием пенициллин, бензилпеиициллин обладает сильной химиотерапевтической активностью, но активен лишь в отношении грамположительиых микробов и не действует на устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки, образующие фермент -лактамазу. Бензилпенициллин быстро теряет свою активность в кислой и щелочной средах, поэтому его нельзя применять внутрь, так как он разрушается в желудочно-кишечном тракте.

    Полусинтетические препараты получают также на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин, цефалоридин (цепории) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например рифампицип - эффективный противотуберкулезный препарат.

 

Биологический синтез.

Полностью химическая структура установлена одной трети известных антибиотиков и только половина из них может быть получена химическим синтезом. Поэтому микробиологический синтез получения антибиотических средств очень актуален.

   Синтез микроорганизмами антибиотиков - одна из форм проявления антагонизма; связан с определенным характером обмена веществ, возникшим и закрепленным ходе его эволюции, то есть это наследственная особенность, выражающаяся в образовании одного и более определенных, строго специфичных для каждого вида антибиотических веществ.

    Промышленное получение антибиотиков, как правило, осуществляется путем биосинтеза и включает следующие стадии:

• выбор высокопроизводительных штаммов продуцента (до 45 тыс. ЕД/мл)
• выбор питательной среды;
• процесс биосинтеза;
• выделение антибиотика из культуральной жидкости;
• очистка антибиотика.

   Выбор высокопроизводительных штаммов продуцента. Природные штаммы в большинстве своем малоактивны и не могут использоваться для промышленных целей. Поэтому после отбора наиболее активного природного штамма для повышения его продуктивности применяют различные мутагены, вызывающие стойкие наследственные изменения. Эффективными мутагенами являются мутагены физической природы - ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, быстрые нейтроны или химические вещества. Использование мутагенов позволяет не только повысить продуктивность природного штамма, но и получать штаммы с новыми неизвестными для природного микроорганизма свойствами.

    Большое значение для биосинтеза антибиотика имеет подбор рационального состава питательных сред. Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, источники ряда микроэлементов, витамины и ростовые вещества), но также и физико-химические и физические факторы (активная кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы взаимосвязаны и играют существенную роль при развитии микроорганизмов.

Подбирая среды нужного состава, следует учитывать специфику культивируемого организма. Это необходимо для создания оптимальных условий, которые бы способствовали наилучшему росту микроба и биосинтезу необходимых продуктов жизнедеятельности. Например, если организм не может синтезировать некоторые существенные для него жизнедеятельности соединения (как например, аминокислоты или витамины) из простых веществ субстрата, то для его развития следует в состав ввести готовые аминокислоты или витамины. К таким «требовательным» организмам относятся некоторые виды бактерий (молочнокислые и др.). Актиномицеты и преимущественно плесневые грибы, как правило, строят вещества своего тела и довольно сложные по составу конечные продукты обмена из соединений, образуемых из простых компонентов субстрата.

 

Методы культивирования продуцентов антибиотиков

    В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков или других биологически активных соединений признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.

   Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

- Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

- Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго - в третий и т. д. Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.

- Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков. В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется исходя из наиболее выгодного для максимального биосинтеза антибиотика или другого биологически активного соединения.

 

Еще один метод культивирования микроорганизмов - поверхностное культивирование. Метод поверхностного культивирования на различных агаризованных средах широко применяется в лабораторной практике и в некоторых промышленных процессах, в частности для сохранения коллекционных культур, для изучения физиологических и биохимических свойств микроорганизмов, для аналитических целей. В промышленном масштабе этот метод нашел применение при получении спорового материала для производства органических кислот с помощью плесневых грибов рода Aspergillus. При поверхностном методе культуру микроорганизма-продуцента выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой или твердой среда. Жидкие питательные среда используют в основном при производстве органических кислот (лимонной, итаконовой), твердые - при производстве комплексов на основе крахмального и целлюлозу содержащего сырья.

   Методы выделения антибиотиков из культуральной жидкости весьма разнообразны и определяются химической природой антибиотика. В основном используют следующие методы:

 

1. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки.

Определенная навеска почвы, тщательно растертая в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносится в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивается в течение 5 мни, а затем из водной суспензии делается ряд последовательных разведений, которые высеваются на соответствующую авизированную среду.

Для получения в дальнейшем чистых культур отдельные колонии после инкубация в термостате при нужной температуре пересеваются в пробирки со скошенным питательным агаром. Каждая чистая культура микроорганизма пересевается на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяются ее антибиотические свойства.

 

2. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом.

Поверхность питательного агара засевается тест - культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие, не более просяного зерна, комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и подвергают их дальнейшему изучению.

 

3. Метод обогащения почвы

Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помешенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов.

Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.

 

4. Метод центрифугирования почвенной  суспензии

Для выделения актиномицетов из почв и особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяетсяметод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актиномицетов, оказываются при данной скорости центрифугирования в поверхностном слое жидкости. Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев (до 92%) получить на пластинках питательного агара только колонии актиномицетов.

 

5. Метод замораживания - оттаивания  почвы

Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбированном на почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяются различные методы: химические, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.

   Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания – оттаивания почвы. Суть метода состоит в следующем. Отобранный для выделения актиномицетов образец почвы помещается в испаритель бытового холодильника при температуре 8°. Через час образец извлекается из холодильника и выдерживается при комнатной температуре до полного оттаивания. Процедуру замораживания-оттаивания повторяют дважды. Затем навеску почвы помещают в стерильную водопроводную воду, взбалтывают суспензию в течение 15 мин на круговой качалке при 230 об/мин, после чего различные разведения суспензии высевают на питательную агаровую пластинку в чашках Петри.

    Метод замораживания - оттаивания образцов почвы позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше актиномицетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-видимому, связано с повышением десорбции актиномицетов с поверхности почвенных частиц. Очистка антибиотика производится хроматографическими методами (хроматография на оксиде алюминия, целлюлозе, ионитах) или противоточной экстракцией. Очищенные антибиотики подвергают лиофильной сушке. После выделения антибиотика проводят испытания его чистоты. Для этого определяют его элементный состав, физико-химические константы (температуру плавления, молекулярную массу, адсорбцию в видимой, УФ- и ИК-областях спектра, удельное вращение). Исследуют также антибактериальную активность, стерильность и токсичность антибиотика.

  

    Токсичность антибиотиков определяют на экспериментальных животных, которым в течение определенного периода внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или иным путем вводят различные дозы изучаемого антибиотика. При отсутствии внешних изменений в поведении животных в течение 12-15 сут считают, что испытуемый антибиотик не обладает заметными токсическими свойствами. При более глубоком исследовании выясняют, обладает ли данный антибиотик скрытой токсичностью и влияет ли на отдельные ткани и органы животных.

  Одновременно исследуют характер биологического действия антибиотика - бактериостатический или бактерицидный, что позволяет прогнозировать механизмы его антибактериальных свойств.

 

    Следующий этап изучения антибиотика - оценка его терапевтических свойств. Экспериментальных животных заражают определенным видом патогенного микроба. Минимальное количество антибиотика, предохраняющее животного от смертельной дозы инфекции, является минимальной терапевтической дозой. Чем больше отношение токсичной дозы антибиотика к терапевтической, тем выше терапевтический индекс. Если терапевтическая доза равна токсической или приближается к ней (низкий терапевтический индекс), то вероятность применения антибиотика в лечебной практике ограничена или совсем невозможна.

   В том случае, когда антибиотик входит в широкую медицинскую практику, разрабатывают промышленные методы его получения и детально изучают его химическую структуру.

 

Стандартизация антибиотиков.

   За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Величину биологической активности антибиотиков выражают обычно в условных единицах дозы (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). Например, за единицу антибиотической активности пенициллина принято считать минимальное количество препарата, способное задерживать рост золотистого стафилоккока стандартного штамма 209 в 50 мл питательного бульона. Для стрептомицина за единицу активности принято считать минимальное количество антибиотика, задерживающее рост Е. coli в 1 мл питательного бульона.

После того как многие антибиотики были получены в чистом виде, для некоторых из них стали выражать биологическую активность в массовых единицах. Например, установлено, что 1 мг чистого основания стрептомицина эквивалентен 1000 ЕД. Следовательно, 1 ЕД активности стрептомицина эквивалентна 1 мкг чистого основания этого антибиотика. Поэтому в настоящее время в большинстве случаев количество стрептомицина выражают в мкг/мг или мкг/мл. Чем ближе число мкг/мг в препаратах стрептомицина к 1000, тем, следовательно, чище препарат. Понятно, что единица биологической активности антибиотика не всегда совпадает с 1 мкг. Например, для бензилпенициллина 1 ЕД эквивалентна примерно 0,6 мкг, так как 1 мг антибиотика содержит 1667 ЕД.