Ветеринарная вирусология

Заражение культур клеток производится внесением в пробирку или матрас с выросшим монослоем клеток вируссодержащего материала и после небольшой  выдержки (0,5-1,5 часа), необходимой для  адсорбции вируса на клетках, добавляется поддерживающая питательная среда (т. е. среда, не обеспечивающая дальнейшее размножение клеток). При дальнейшей инкубации в термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки и репродуцируются в них; затем вирусы выходят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, из них в следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.

Обнаружение вируса, размножающегося  в культуре клеток, производят в  основном по цитопатическому действию (ЦПД). ЦПД - это любые изменения  клеток, под влиянием размножающегося  в ней вируса. Наиболее быстро и  просто обнаруживаются морфологические  изменения, путем просмотра зараженных культур клеток под малым увеличением микроскопа. Наблюдаемые формы ЦПД весьма разнообразны (от едва заметных изменений в цитоплазме до полного распада клеток на фрагменты).

Обнаружение в культуре клеток вируса, способного вызывать гемагглюти- инацию (склеивание эритроцитов) возможно методом  гемадсорбции. Гемадсорб- цией называется прилипание (адсорбция) эритроцитов  крови к поверхности кле- 
ток, зараженных гемагглютинирующим вирусом. Чтобы наблюдать гемадсорбцию, из пробирки с зараженной вирусом культурой клеток удаляют культуральную жидкость вносят 2-3 капли 0,5% -ной суспензии эритроцитов. Пробирку оставляют лежать горизонтально около 10 минут, после чего слой клеток слегка споласкивают физраствором (чтобы смыть эритроциты). Одновременно то же проделывают с пробиркой, в которой та же культура клеток, но не зараженная (контроль). Если в зараженной культуре клеток идет репродукция вируса, на таких клетках под микроскопом можно видеть адсорбировавшиеся эритроциты при отсутствии таковых в контроле.

Размножающиеся в культурах  клеток вирусы частично или полностью (в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культуральную жидкость, которая и используется после этого как готовая суспензия , вируса. Если не все клетки культуры успели самопроизвольно разрушиться под влиянием размножения в них вируса, можно добиться выхода из них вируса в жидкость дезинтеграцией клеток путем 2-3-кратного замораживания и оттаивания.

Вирусологические методы исследования

методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В  вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью  которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы  проникновения их в клетку и особенности  репродукции вирусов, первичной  структуры вирусных нуклеиновых  кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых  кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции  нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с  антителами), биологических свойствах  вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с  клеткой-хозяином (характер цитопатического  эффекта, образование внутриклеточных  включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении  и идентификации вирусов, а также  при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и  диплоидные клеточные культуры. Первичные  культуры получают при диспергировании  ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и  животных. Суспензию клеток в питательной  среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности  сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную  жидкость сливают, вносят вирусную суспензию  в определенных разведениях и  после контакта с клетками добавляют  свежую питательную среду, обычно без  сыворотки.

Клетки большинства первичных  культур могут быть пересеяны, такая  культура называется вторичной. При  дальнейшем пассировании клеток формируется  популяция фибробластоподобных  клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет  исходный набор хромосом. Это так  называемые диплоидные клетки. При  серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные  культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные  культуры растут в виде сплошного  слоя на поверхности стекла, суспензионные  — в виде суспензий в различных  сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий  клеток, полученных от 40 различных видов  животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных  средах можно культивировать кусочки  отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют  структуру ткани, что особенно важно  для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются  в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах  вирусы можно обнаружить по изменению  морфологии клеток, цитопатическому  действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения  циркулирующего среди населения  типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых  типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения  предварительного диагноза; для индикации  вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают  возможность их персистирования  в организме человека, а также  возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция  вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам  процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов  применяют заражение восприимчивых  лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию  симпластов и синцитиев, обнаружению  внутриклеточных включений, а также  специфического антигена, выявляемого  с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут  обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения  некоторых вирусов Коксаки и  ряда арбовирусов — новорожденных  мышей. Идентификацию выделенных вирусов  проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя  наибольшее разведение вируссодержащей  жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения  и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно  использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных  под действием вируса клеток однослойной  культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.

Очистку и концентрацию вирусов  обычно осуществляют путем дифференциального  ультрацентрифугирования с последующим  центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов  применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика  вирусных инфекций включает обнаружение  возбудителя или его компонентов  в клиническом материале; выделение  вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики  в каждом отдельном случае зависит  от характера заболевания, периода  болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через  несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним  относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также  иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител  класса lgM и др.

Электронная микроскопия  вирусов, окрашенных методом негативного  контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии  в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда  концентрация вирусных частиц в клиническом  материале достаточно высокая (10⁵ в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических  нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет  себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или  РНК (зондов) и формировании двунитчатых  структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й  день болезни) и исчезают через несколько  недель, поэтому их обнаружение свидетельствует  о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом  иммунофлюоресценции или с помощью  иммуноферментного анализа, используя  анти- μ-антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в  вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях . Реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител  к ним в сложных смесях без  предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью  электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет  выявлять индивидуальные пары антиген  — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции  иммуноферментного анализа обусловлены  наличием антител к клеточным  антигенам, которые присутствуют в  результате недостаточной очистки  вирусных белков. Идентификация антител  в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет  определять стадию заболевания, а при  анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при  ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител  к ним. При анализе популяций  метод используют для определения  изменчивости вирусных белков. Большая  ценность метода заключается в возможности  анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.

3. В промышленном комплексе  откормочного типа среди телят  5-8-месячного возраста возникло  заболевание, которое протекало  со следующими клиническими признаками: лихорадка (39,5-42°С), учащенное и затрудненное дыхание, угнетение, гиперемия и отечность конъюнктивы и слизистой оболочки носовой и ротовой полостей, обильное слезотечение, слюноотделение и истечения из носовой полости слизистого или слизисто-гнойного характера, сильный кашель. Понос через 1-4 дня после появления первых признаков заболевания. Эрозия и язвенные поражения в ротовой полости. Около 10% заболевших телят имели помутнение роговицы глаз. Заболеваемость - 80%, летальность - 8%.