Сибирская язва

Для синтеза важнейшего фактора вирулентности — капсулы - необходимы аминокислоты лейцин, валин и метионин. Для оптимального размножения вирулентных штаммов бацилл требуются гипоксантин, метионин, аланнн и триптофан. Степень вирулентности во многом определяется условиями выращивания бацилл и составом среды.

В экспотенциалыюй фазе роста культуры вирулентных вакцинных штаммов наряду с капсульными выявляют и бескапсульные бациллы. Это свидетельствует о том, что в популяции штаммов появляются мутанты с иными генетическими свойствами, без капсульного полипептида глутамниовой кислоты.

В организме животного бациллы с капсулами обнаруживают через 2—3 ч после заражения, но в этот период их находят только в местах введения и регионарных лимфатических узлах. Они окружены тканевым детритом и расположены в зонах (светлых), обрадованных действием токсина микроба. При попадании бацилл в иммунный организм капсулы, по-видимому, образуются очень медленно и довольно редко. Морфологически капсулы бацилл, размножающихся в организме и выращенных па питательных средах, но имеют различия, только у последних капсула более массивная. Капсула более устойчива к процессам гниения, чем сама бацилла, поэтому в гниющем трупе животного, павшего от сибирской язвы, обнаруживают лишь «тени микробов», пустые капсулы.

Образование спор. Биологическая роль спор заключается в том, что они являются формой сохранения вида бацилл при неблагоприятных условиях существования. Споры могут длительное время находиться в природе, а следовательно, долго сохранять субстрат генетической информации исходных клеток (геном) и тем самым обеспечивать передачу основных свойств потомству последующих генераций.

Спорообразование происходит в средах с нейтральной пли слабощелочной реакцией при дефиците белковых веществ. Споры образуются в физиологическом растворе, дистиллированной воде, в нефиксированных мазках. Установлено, что этот процесс происходит быстрее в среде, содержащей чистый кислород, чем при аэрации культуры атмосферным воздухом. Образованно спор начинается с того момента, когда в среде соотношение форм белкового и минерального азота сдвигается в сторону преобладания последнего (Егоров и Сиицин, 1961). Добавление к среде нейтрального щавелевокислого натрия активизирует спорообразование, а 1%-лого раствора хлористого кальция — подавляет. Споры не образуются в средах, богатых белковыми веществами, например в крови и сыворотке крови, в живом организме и невскрытом трупе. При нарушении целостности трупа возможно спорообразование.

Вегетативные клетки, образующие споры (спорангии), содержат по одной споре, расположенной центрально или субтерминально. Диаметр споры не превышает ширину бациллы. Формирование споры начинается в момент перехода вегетативной клетки к стационарной фазе роста, при этом наблюдается ряд последовательных стадий:

1. В клетке формируется  два нуклеоида, которые вскоре объединяются в палочковидное образование.

2. В одном участке клетки  появляются выпячивания клеточной  мембраны с мезосомой. Они формируют поперечную перегородку, которая отделяет свободную от липопротеиновых зерен часть цитоплазмы и ДНК от остального содержимого клетки. В результате этого изолируется участок будущей споры, окруженный мембраной.

3. Изолированный участок  окружается мембраной клетки; образуется  проспора с двойной мембраной.

4. Пространство между  споровой и клеточной (второй) мембранами  расширяется, содержимое его становится  гомогенным, возникает так называемый кортекс, благодаря которому спора более заметна при микроскопическом исследовании.

5. Вокруг наружной мембраны, покрывающей кортекс, формируется оболочка. Из всех структур споры она отличается наибольшей способностью рассеивать электроны. Затем споровая оболочка покрывается более рыхлым и тонким слоем — экзоспориумом. Сформированная спора выходит из бациллы через разрыв участка клеточной стенки. Внутри бациллы споры не прорастают.

Таким образом, сформировавшаяся спора состоит из следующих основных слоев:

- спороплазмы (центральная  ее часть). Состоит она из гомогенного  материала с мелкозернистыми  осмиофильными гранулами; нуклеоид обнаруживают в виде нечетко контурированной зоны осмиофобного материала;

- цитоплазматической внутренней  мембраны, окружающей саркоплазму;

- кортекса, расположенного на поверхности цитоплазматической мембраны. Представлен он массивным светлым оптическим слоем, состоит из пептидогликана. Из внутреннего его слоя формируется оболочка при проростании споры:

- внешней двухслойной  мембраны споры толщиной и  покрывающей кортекс;

- слоя цитоплазмы между  внешней мембраной и оболочной

споры;

- оболочки споры, по данным  И.И. Белоконова (1970), Т.А. Тржецецкой, Л.В. Куликовского (1972), она имеет до 6 слоев; внутренней стороной оболочка прилегает к внешней мембране споры, с внешней — имеет множественные выпячивания;

- экзоспориума.

Споры — овальные, иногда округлые образования, сильно преломляющие свет. Длина прелых спор 1,2—1,5 мкм, ширина 0,8— 1 мкм, незрелых (проспоры) — несколько меньше. Зрелые споры, оттененные хромом или контрастированные фосфорно-вольфрамовой кислотой, выявляются в электронном микроскопе в виде оптически непроницаемых образований с неровными контурами; более молодые споры и проспоры однородны, темные. Метод углеродных реплик по Bredli и Williams (1957) позволяет обнаружить на поверхности спор ребра. Они располагаются продольно или в виде ячеек и четче выражены у спор из старых культур (15 сут.) (Белоконов, 1970). Shafa и Sato (1966), исследовавшие штамм Стерна, выявили на поверхности экзоспориума ворсинки. Наличие их подтвердил

И.И. Белоконов (1970), научавший вакцинные штаммы СТИ-1 и II вакцины Ценковского.

У спор вакцинного штамма СТИ-1 обнаружены паро-споровые тельца, подобные тем, которые ранее были описаны у некоторых сапрофитных спорообразующих микробов. Они имеют правильную сферическую форму, расположены на поверхности спор пли лежат раздельно. Диаметр их разный: мелких 1200. А, средних 1564 А и крупных 2000 А. Значение этих телец не выяснено (Дунаев и Белоконов, 1968).

Начало образования спор зависит от особенностей штамма и температуры среды. При 30— 37 °С оно обычно заканчивается через 1 — 2 ч, при 24°С — через 16 ч, при 18°С затягивается до 70 ч. Ниже 15°С и выше 42С спорообразование не происходит. У некоторых штаммов интенсивно этот процесс начинается через 18—20 ч с момента засева среды и культивирования при 37 °С (Белоконов, 1970; Авакян, Кац, Павлова, 1972). На плотных средах споры образуются быстрее, чем в жидких. Процесс их формирования у хорошо спорулирующих штаммов обычно завершается на МПА через 48—72 ч.

Для прорастания спор необходимы аминокислоты (источник азота), углеводы (особенно глюкоза) и предшественники нуклеиновых кислот, 1-аланин н 1-тирозин (Земсков н соавт., .1972).

Морфологические изменения, свидетельствующие о начале прорастания спор, выявляются через 5—10 мин после засева их на питательную среду (температура 37°С). Они характеризуются набуханием спор и появлением по их периферии небольших светлых участков. Прорастающая спора теряет блеск, принимает шаровидную форму, затем вновь вытягивается и из одного конца ее выходит бацилла в направлении продольной оси, сбрасывая споровую оболочку; вышедшая бацилла похожа на материнскую сибиреязвенную бациллу, только у нее более закруглены концы.

Химический состав. В сухом остатке вегетативных клеток содержится 6,8% азота и 12—13,5% минеральной золы, в сухом остатке спор — соответственно 12,14 и 41,15%. Количество ДНК варьирует в зависимости от штамма. Наиболее высокий уровень РНК наблюдается у бактерии, находящихся в экспотенцеальной фазе роста. Бациллы сибирской язвы имеют ферменты: липазу, диастазу, протеазу, желатиназу. дегидразу, ци-тохромоксидазу, пероксидазу, каталазу, аргиназу и др.

Из тела микроба выделен соматический антиген, в состав которого входит полисахарид, содержащий в эквимолекулярных пропорциях N-ацетилглюкозамин и галактозу, а также незначительное количество 0-ацетила и остатки аминокислот.

В составе оболочки и капсулы сибиреязвенного микроба обнаружены 3 антигенных комплекса:

поверхностные антигены капсулы, являющиеся, по-видимому, пептидами, чувствительные к действию пепсина и частично трипсина;

собственно капсульные антигены, расположенные в основном слое капсулы, содержат вещества белково-полисахаридной природы, чувствительные к действию трипсина, хемотрипсина, гиалуронндазы и лизоцима;

антигены оболочки клетки, содержащие вещества как полисахаридной, так и белковой природы, чувствительные к действию лизоцима и трипсина (Левина и Кац, 1964; Лвакян н соавт., 1907).

По данным Е.П. Левиной и Л.П. Кац, антигены, обнаруживаемые с помощью флуоресцирующей сибиреязвенной сыворотки, локализованы в оболочке. Споры содержат аланинрацелеазу, нуклеозидрибозидазу, аденозиндезамнназу. У покоящихся спор эти ферменты обеспечивают слабый уровень энергетического обмена (дыхания).

 

1.2 Ферментативная  активность

 

Из многочисленной группы аэробных бацилл, обитающих в почве, только Bacillus anthracis приобрела наиболее выраженные вирулентные свойства и способность вызывать у животных и человека болезнь со смертельным исходом. Она имеет ряд сходных морфологических и культуральных свойств с указанными непатогенными спорообразующими микробами. Особенно много идентичных признаков отмочено у Bacillus anthracis и Вас. сегeus. Имеется большой фактический материал относительно токсикогенности Вас. сегeus и её биохимической активности.

При электронно-микроскопическом исследовании у обеих бацилл (Шахбанов, 1975) выявлены как общие характерные, так и нетипичные признаки. Так, клеточная стенка у Bac. anthracis более толстая и внутри имеется фибриллярный материал, а у Вас. cereus на стенке расположены грибовидные выросты. И.Б. Павлова и Л.П. Кац (1966) выявили у Bac. anthracis более развитые мембранные структуры, что, по их мнению, вызвано большей активностью окислительно-восстановительных ферментов. Вас. cereus в отличие от Bac. anthracis быстро свертывает растворы желтка куриного яйца; имеет чрезвычайно активную лецитиназу. Она медленно редуцирует метиленовый синий, слабо восстанавливает нитраты и нитриты, вырабатывает желатиназу, а также протеазу и достаточно быстро гидролизует желатину и свернутую сыворотку.

 

1.3 Антигенная структура

 

Вас. anthracis изучена еще недостаточно.

Н.Ф. Гамалея (1928) установил, что в подкожном отеке, образующемся на месте введения возбудителя, содержатся ядовитые вещества, вызывающие при введении в кровь быструю гибель кролика. Watson, Bloom (1947) получили экстракты из отёков больных сибирской язвой кроликов. После внутрикожного введения животным экстрактов регистрировали такие же гистологические изменения, как и при заражении литыми бациллами. У кроликов эти экстракты вызывали образование иммунитета, в слабой степени он проявлялся у морских свинок и белых мышей.

Watson и Со11 (1947) выделили у бациллы две субстанции, они различались физическими, химическими и биологическими свойствами. Первая из них вызывала воспаление тканей, стремилась к аноду, вступала в реакцию с фосфатом Са, вторая имела протеиновую природу, была не токсична, обладала иммунизирующими свойствами.

В 1953 г. Smith и Со11 выделили сибиреязвенный экзотоксин из плазмы крови морских свинок, погибших от этой болезни, а затем и из культуральной жидкости при выращивании Вас. anthracis на жидкой питательной среде. Установлено, что токсин не имеет отношения, как полагали раньше, к капсульному веществу, состоящему из полиглютаминовой кислоты, но он обладает близким родством с протективным антигеном.

Smith (1958) выяснил, что токсин содержится не только в отечной жидкости, но и в достаточно высокой концентрации в плазме крови и в меньшем количестве в плевральном и перитонеальном экссудатах. Токсин вызывал не только местную воспалительную реакцию (отек) с явлениями разрушения тканей, но и гибель морских свинок и белых мышей от вторичного шока. Эта токсическая субстанция была обозначена как летальный фактор, а в 1955 г. названа сибиреязвенным токсином.

Сибиреязвенные антисыворотки, полученные от лошадей, ги-периммунизированных как капсульными, так и бескапсульными штаммами бацилл, подавляли действие токсина. Это указывало на то, что происхождение токсина не связало капсулой. Токсин также нейтрализовался сывороткой кроликов, иммунизированных проективным антигеном.

Evans (1954) выделил сибиреязвенный экзотоксин in vitro. Smith (1958) установил, что вирулентные и бескапсульпые вакцинные штаммы синтезируют одинаковые по силе токсины. Максимальной силой токсин обладал к I'/2 ч от начала инкубации. Количество его находилось в прямой зависимости от числа бактерии в культуре. По своим свойствам токсин, полученный в культуре, не отличался от такового, синтезируемого бациллами in vitro; он вызывал образованно антител у животных и нейтрализовался лошадиной противосибиреязвенной сывороткой.

В 1958 г. Smith определил, что у нативного сибиреязвенного токсина четко различаются отечный и летальный факторы. Molner и Strange (1960) разделили токсин на два фактора. Один из них проходил через стеклянный фильтр и обладал свойствами протективного антигена, второй задерживался на фильтре, но легко элюнировался путем обработки 0,1 М карбонатным буфером при рН 9,7. Оба фактора сами по себе не были токсичными, но их смесь проявляла выраженное токсическое действие — вызывала воспалительные реакции в коже морских свинок и гибель мышей. Установлено, что второй фактор состоит из двух антигенов.

Stanley и Smith (1961) показали, что, кроме указанных двух факторов (компонентов), имеется еще одни, серологически отличающийся от них; он присутствовал в токсине, образующемся как в организме, так и в культуре. Эти факторы были обозначены цифрами I, II и III. Веа11, Тау1ог, (1962) предложили другие обозначения: EF (эдематогенный, или воспалительный, фактор); РА (иммуногенный—протективный антиген) и LF (летальный фактор), которые соответствовали I, П и III факторам.