Технология производства тетрациклина

    Можно указать четыре основные  модификации  глубинного способа  выращивания микроорганизмов.

    1)  Периодическое культивирование.  При этом способе весь процесс  развития микроорганизмов полностью  завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается  от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

    2)  Отъемный метод. Культивирование  микроорганизмов осуществляется  в ферментерах с периодическим  отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

    3)  Батарейный способ.  Развитие  микроорганизмов проходит в ряду  последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий.

    Освобожденный ферментер немедленно  заполняется  свежей питательной  средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания  микроорганизмов происходит более  рациональное использование емкостей.

    4)  Непрерывное культивирование.  Метод принципиально отличен  от указанных модификаций глубинного  культивирования продуцентов антибиотиков.

    В основе этого метода лежит  то, что  развитие микроорганизма  происходит в  условиях непрерывного  протока питательной среды, что  позволяет поддерживать развитие  микроорганизма на определенной  стадии его роста

 

 

 

 

2.2 Ферментеры.

 

Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.

Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами.

Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6]

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.

Наблюдение  за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.

В современных ферментерах контрольно-измерительная  аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.

В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.

Лабораторные  ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.

Полупроизводственные  ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали.

Производственные  ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50 и 100 м3.

Стерилизация  полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем.

Использование волокнистых фильтров — широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем, чем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность.

 

    2.3 Приготовление и стерилизация питательной среды.

   

Питательная среда – субстрат предназначенный для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов.

Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне. Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления. Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С. При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.

 

Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С. Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин. Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды. Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки. Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С. 

2.4 Подготовка  почвенного материала.

Подготовка  посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле  биотехнологического метода получения тетрациклина. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез тетрациклина. Продуцент обычно тетрациклина выращивается на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации.  Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор,  после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в основном ферментере.  Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор. 

2.5 Развитие  продуцента тетрациклина в ферментёрах. 

Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент условий развития организма — продуцента тетрациклина. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляется биологический контроль, учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата: источников углерода, азота, фосфора; внимательно следят за образованием антибиотика.

    Существенное  внимание при развитии  продуцента в  ферментерах обращают  на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.

    Для борьбы с пеной в ферментерах  при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла, животный жир, а иногда минеральные масла, спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества.

    Многие  вещества (масла, жиры, спирты), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода тетрациклина. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. Общая схема производства тетрациклина до стадии выделения и химической очистки представлена на рисунке 1.

Схема производства тетрациклина(рис1): I - приготовление посевного материала; II - инокуляторы для наращивания посевного материала; III - стерилизатор среды для большого ферментатора; IV - установка для биосинтеза антибиотика; а - стерилизация среды в колбах; б - охлаждение и посев культуры продуцента в колбу; в - рост культуры в покое; г - рост культуры в качалке; д - инокулятор со стерильной средой; е - инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента; ж - фильтры и компрессор; з - резервуар со сжатым воздухом; и - нагрев воздуха; к - ферментатор; л - рубашка для охлаждения ферментатора.