Природе и явления биотехнологий

Субстраты для получения  белка одноклеточных для разных классов микроорганизмов.

Создание иммобилизованных ферментов, так называемая инженерная энзимология (Ферме́нты или энзи́мы (от лат. fermentum, греч. ζύμη, ἔνζυμον — дрожжи, закваска) — обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах. Реагенты в реакции, катализируемой ферментами, называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами. Ферменты специфичны к субстратам (АТФаза катализирует расщепление только АТФ, а киназа фосфорилазы фосфорилирует только фосфорилазу). Ферментативная активность может регулироваться активаторами и ингибиторами (активаторы — повышают, ингибиторы — понижают). Белковые ферменты синтезируются на рибосомах, а РНК — в ядре. Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый в основном в русской и немецкой научной литературе, второй — в англо- и франкоязычной). Наука о ферментах называется энзимологией, а не ферментологией (чтобы не смешивать корни слов латинского и греческого языков).), — одно из новых направлений биотехнологий. Достигнуты лишь первые успехи. Но они существенно преобразили прикладную микробиологию, техническую биохимию и ферментную промышленность. Во-первых, в микробиологической промышленности сейчас актуальными стали разработки производства ферментов самой различной природы и свойства. Во-вторых, возникли новые области производства, связанные с получением именно иммобилизованных ферментов. В-третьих, создание новых ферментных препаратов открыло возможность организации ряда новых производств для получения нужных веществ с помощью биологические катализаторов.

Плазмиды

Наибольшие успехи были достигнуты в области изменения  генетического аппарата бактерий. Вводить новые гены в геном бактерии научились с помощью небольших кольцеобразных молекул ДНК — плазмид, присутствующих в бактериальных клетках. В плазмиды «вклеивают» необходимые гены, а затем такие гибридные плазмиды добавляют к культуре бактерий, например кишечной палочки. Некоторые из этих бактерий поглощают такие плазмиды целиком. После этого плазмида начинает реплицироваться в клетке, воспроизводя в клетке кишечной палочки десятки своих копий, которые обеспечивают синтез новых белков.

Генная инженерия

Сейчас созданы и  создаются ещё более остроумные методы введения генов в клетку прокариотов (организмов, не имеющих оформленного ядра и хромосомного аппарата). На очереди  разработка методов введения новых  генов в клетки эукариотов, прежде всего высших растений и животных организмов.

Но и то, что уже  достигнуто, позволяет сделать очень  многое в практике народного хозяйства. Возможности микробиологического  производства значительно расширились. Благодаря генетической инженерии  область микробиологического синтеза различных биологически активных соединений, полупродуктов для синтеза, кормовых белков и добавок и других веществ стала одной из наиболее окупаемых наук: вложение средств в перспективные биотехнологические исследования обещает получение высокого экономического эффекта.

Для селекционной работы, независимо от того, проводится она  методами мутагенеза или «индустрии ДНК», учёные должны располагать многочисленными  коллекциями микроорганизмов. Но сейчас даже выделение нового штамма (Штамм (от нем. Stammen, буквально — происходить) — чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и месте. Поскольку многие микроорганизмы размножаются митозом (делением), без участия полового процесса, по существу, виды у таких микроорганизмов состоят из клональных линий, генетически и морфологически идентичных исходной клетке. Штамм не является таксономической категорией, наинизшим таксоном у всех организмов является вид, один и тот же штамм не может быть выделен второй раз из того же источника в другое время.[1]) природных микроорганизмов, ранее неизвестных науке, обходится на мировом «рынке бактериальных культур» приблизительно в 100 долларов. А для того, чтобы получить хороший промышленный штамм обычными селекционными методами, надо иногда затратить миллионы.

Сейчас уже существуют способы ускорить и удешивить  эти процессы. Например, во Всесоюзном научно-исследовательском институте  генетики и селекции микроорганизмов  Главмикробиопрома был получен  промышленный штамм-сверхпродуцент микроорганизма, синтезирующего треонин — незаменимую аминокислоту, которая в кормах сельскохозяйственных животных содержится в недостаточном количестве. Добавка треонина в корм повышает привесы животных на килограммы, что в масштабах страны оборачивается миллионами рублей прибыли, а самое главное — приростом мясной продукции животноводства.

Коллектив учёных института  под руководством директора В. Г. Дебабова за основу для получения  промышленного штамма взял обыкновенную кишечную палочку — повсеместно распространённый микроорганизм. Сначала были получены мутантные клетки, способные накапливать в среде избыток треонина. Затем в клетке были вызваны генетические изменения, которые привели к усилению биосинтеза аминокислот. Таким путём удалось получить штамм, который производил треонин, но в 10 раз меньше того количества, которое требовалось по соображениям рентабельности производства. Тогда в дело были выпущены методы генетической инженерии. С их помощью была увеличена «доза треонинового гена» в молекуле бактериальной ДНК. Причём количество генов, обусловливающих синтез треонина, было в молекуле ДНК клетки увеличено в несколько раз: одинаковые гены оказались как бы нанизанными один за другим в молекуле ДНК. Естественно, биосинтез треонина пропорционально увеличился и достиг уровня, достаточного для промышленного производства.

Правда, после этого  штамм пришлось ещё улучшать, причём снова генетически. Сначала для  того, чтобы культуру бактерий очистить от клеток, в которых плазмиды с  «треониновым геном» исчезали в процессе размножения культуры. Для этого в клетки был «вшит» ген, содержащий закодированный сигнал к «самоубийству» клеток, в которых плазмид с «треониновым геном» после деления не оказывалось. Таким путём культура клеток самоочищалась от балластных микроорганизмов. Затем в клетки был введён ген, благодаря которому она могла развиваться на сахарозе (а не дорогих глюкозе и фруктозе, как раньше) и производить рекордные количества треонина.

По существу, полученный микроорганизм уже не был кишечной палочкой: манипуляции с его генетическим аппаратом привели к появлению принципиально нового организма, сконструированного вполне сознательно и целенаправленно. И эта сложнейшая многоступенчатая работа, имеющая огромное практическое значение, была проведена с помощью новых оригинальных методов генетической инженерии за очень короткий срок — всего за три года.

К 1981 г. в ряде институтов страны, и прежде всего в Институте  биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР под руководством академика  Ю. А. Овчиникова, были выполнены ещё более впечатляющие работы. Эти исследования приобрели сейчас форму чётких долгосрочных программ, по которым их развивают дальше ряд академических и отраслевых институтов. Эти исследования были направлены на то, чтобы осуществить поистине чудо — ввести в бактериальную клетку ген, выделенный из человеческого организма.

Работа велась сразу  с несколькими генами: геном ответственным  за синтез гормона инсулина, геном, обеспечивающим образование интерферона, и геном, контролирующим синтез гормона роста.

Прежде всего учёные поставили перед собой задачу «обучения» бактерии синтезу ценнейшего медицинского препарата — гормона  инсулина. Инсулин необходим для  лечения сахарного диабета. Этот гормон надо вводить больным постоянно, а производство его традиционным способом (из поджелудочных желез убойного скота) сложно и дорого. К тому же молекулы инсулина свиньи или крупного рогатого скота отличаются от молекул инсулина человека, и естественно, что активность их в организме человека ниже, чем активность человеческого инсулина. Кроме того, инсулин — хотя и небольшой по размерам, но всё же белок, и в организме человека со временем накапливаются антитела к нему: организм борется против чужеродных белков, отторгает их. Поэтому введённый бычий или свиной инсулин может начать необратимо инактивироваться, нейтрализовываться этими антителами и в результате может исчезнуть прежде, чем успеет оказать лечебное действие. Чтобы этого не произошло, необходимо вводить в организм вещества, предотвращающие этот процесс, но они сами по себе не безразличны для организма.

Человеческий инсулин  можно было бы получать с помощью  химического синтеза. Но этот синтез настолько сложен и дорог, что  его проводили только в экспериментальных  целях, а полученные количества инсулина были недостаточны даже для одной инъекции. Это был, скорее, символической синтез, доказательство того, что химики могут синтезировать в пробирке настоящий белок.

Учитывая всё это, учёные и поставили перед собой такую  сложную и очень важную задачу — наладить биохимическое производство человеческого инсулина. Был получен ген, обеспечивающий синтез инсулина. С помощью методов генетической инженерии этот ген был введён в бактериальную клетку, которая в результате приобрела способность синтезировать гормон человека.

Столь же большой интерес  и не меньшее (а может быть, и  большее) значение имела работа, выполненная  в том же институте, по введению методами генетической инженерии в бактериальную  клетку гена, ответственного за синтез интерферона человека. (Интерферон — это белок, играющий исключительно важную роль в борьбе организма против вирусных инфекций.) Ген интерферона также был введён в клетку кишечной палочки. Созданные штаммы отличались высоким выходом интерферона, обладающего мощным противовирусным действием. Сейчас уже получены первые промышленные партии человеческого интерферона. Осуществление промышленного производства интерферона — очень важное достижение, так как предполагают, что интерферон обладает также и противоопухолевой активностью.

В институте АН СССР были проведены работы по созданию бактериальных клеток, продуцирующих соматотропин — гормон роста человека. Ген этого гормона был выделен из гипофиза и методами генетической инженерии встроен в более сложную молекулу ДНК, которую затем ввели в генетический аппарат бактерии. В результате бактерия приобрела способность синтезировать человеческий гормон. Эта бактериальная культура, так же как и культура бактерий с введённым геном инсулина, апробируется для промышленного получения человеческих гормонов в микробиологическом производстве.

Это лишь отдельные примеры  работ по введению генов высших организмов в клетки бактерий. Есть ещё немало подобных интересных и перспективных  работ.

Вот ещё один пример. Английские биохимики  из плодов одного африканского кустарника выделили довольно крупный белок (около 200 аминокислотных остатков) — тауматин. Этот белок оказался в 100 тыс. раз слаще сахарозы. Сейчас во всём мире думают над созданием заменителей сахара, который при большом потреблении далеко не безвреден для организма. Поэтому тауматин — природный продукт, не требующий специальных токсикологических испытаний, — привлёк пристальное внимание: ведь ничтожные его добавки в кондитерские изделия позволяют просто исключить использование сахара. Учёные решили, что получать тауматин проще и выгоднее не из естественного источника, а микробиологическим синтезом с помощью бактерий, в которые введён ген тауматина. И эту работу выполнили, введя этот ген во всё ту же кишечную палочку. Сейчас пока заменитель сахара тауматин (под названием «талин») производят из природного источника, но не за горами и его микробиологическое производство.

Пока речь шла о введении генов  в клетки бактерий. Но это не означает, что не ведётся работа и по введению искусственных генов в высшие организмы — растения и животных. Здесь не меньше, а гораздо больше привлекательных идей. Практическое воплощение некоторых из них будет иметь для человечества исключительно важное значение. Так, известно, что высшие растения не могут усваивать азот атмосферы: они получают его из почвы в виде неорганических солей или в результате симбиоза с клубеньковыми бактериями. Осуществление идеи — ввести гены этих бактерий в растения — может привести к коренным революционным изменениям в сельском хозяйстве.

Как же обстоят дела с введением генов в генетический аппарат эукариотов? Основная трудность здесь заключается в том, что изменить генотип всех клеток многоклеточного организма невозможно. Поэтому надежды связывают с созданием методов генетической инженерии, предназначенных для работы с культурами клеток растений и с одноклеточными растениями.

Введение синтетических генов  в искусственно культивируемые клетки может привести к получению модифицированного  растения: при определённых условиях изолированные клетки могут превращаться в целые растения. И в таком растении должны действовать и передаваться по наследству искусственно введённые в исходную клетку гены.

Здесь помимо перспектив успешного  использования методов генетической инженерии вырисовывается ещё одно преимущество биотехнологии — методом клеточной биотехнологии из одного растения можно получить миллионы одинаковых растений, а не десятки, как при использовании семян. Клеточная технология не требует больших площадей, не зависит от погодных условий и отличается огромной производительностью.

Советские учёные сейчас исследуют  ещё один путь введения генов в  клетки растений — создают симбиотическое сообщество, где в протопласты  растений (они лишены целлюлозной  оболочки) пытаются внедрить цианобактерии, которые способны и к фотосинтезу, и к азотфиксации.

Определённые перспективы имеются  и в области использования  методов генетической инженерии  в работе с животными, во всяком случае существует принципиальная возможность  переноса генетического материала  в клетки животных. Особенно убедительно это показано на гибридомах. Гибридома — это клетка, образованная из лимфоцита, вырабатывающего антитела, и опухолевой клетки, способной к неограниченному размножению, и сочетающая оба эти свойства. С помощь гибридом можно получать высокоспецифичные антитела. Метод гибридом — это ещё один биотехнологический приём получения ценных белков.