Научно-образовательный комплекс по кредитной технологии обучения

5. СЫРЬЕ ДЛЯ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ  
   ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

 
Сырье для процессов ферментации  прежде всего решает проблему формирования питательных сред, в которых должны содержаться необходимые элементы для построения биомассы микро- организмов; среда является также средой обитания микроорганизмов.  
Мы уже касались вопросов элементного состава биомассы микроорганизмов, главным образом основных элементов, составляющих до 95--96% сухой массы клеток. Это углерод (50%), водород (8%), кислород (20%), азот (14%), фосфор (3%) и сера (1%).  
Кроме того, в клетках содержится 3—4% макроэлементов — таких, как калий (до 1%), натрий (до 1%), кальций (до 0,5%), магний (до 0,5%) и железо (до 0,2%). Их содержание в биомассе сравнительно велико.  
Микроэлементы входят в биомассу в следовых количествах (в целом до 0,3%), в том числе марганец, кобальт, медь, молибден, цинк, бор и др. Повышенные концентрации этих элементов оказывают ингибирующее действие на развитие микроорганизмов, но без их микродоз обойтись нельзя.  
Витамины требуются для развития многих микроорганизмов ауксогетеротрофоов — неспособных синтезировать их самостоятельно. Чаще всего необходим комплекс витаминов группы В - тиамин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота, пиридоксин, инозит и биотин (последнего недостает чаще всего). Но количество витаминов требуется довольно малое (тысячные доли миллиграмма в литре среды), они могут находиться в натуральном сырье.  
Потребности микроорганизмов в питании разнообразны, они идут от физиологии и являются основой рецептуры сред. Универсальных сред нет.  
По физическому состоянию среды могут быть твердые (агар-агар, желатин и т. д.), жидкие и сыпучие (увлажненные отруби, зерно, солома, опилки).  
П о с о с т а в у среды могут быть натуральными или синтетическими. Натуральные среды включают в себя продукты животного или растительного происхождения, сложные и непостоянные по составу. Синтетические среды составляются из определенных  
химических соединений, обычно из небольшого числа веществ. Они более дороги и менее продуктивны. В них-то и необходимо вносить макро- и микроэлементы, а также витамины.  
Сырье представляет собой имеющиеся в распоряжении конкретные вещества, чистые или комплексные, которые содержат необходимые питательные компоненты. Они должны быть доступными и не очень дорогими и не содержать вредных примесей. Поэтому на каждый вид используемого сырья (в том числе и натурального) должны быть стандарты, определяющие его качество.  
Вода — по массе самый значительный вид сырья, хотя и самый дешевый. Например, на 1 т пекарских дрожжей при производстве расходуется 150—180 м3 воды. Многие виды продуктов биотехнологии определяются качеством воды (взять хотя бы пиво, вино). Рассмотрим основные требования к этому виду сырья.  
Вода должна быть биологически чистой (не более 100 микроорганизмов в 1 мл воды), бесцветной, без привкуса и запаха, не должна давать осадка. Сухой остаток воды после выпаривания — не более 1 г/л, общая жесткость — не более 7 мг-экв/л. Слишком жесткая вода неблагоприятно влияет на процессы ферментации. По содержанию вредных примесей введены следующие ограничения:  
свинец —до 0,1 мг/л;  
мышьяк — до 0,05 мг/л;  
фтор—до 1,5мг/л;  
цинк — до 5,0 мг/л;  
медь — до 3,0 мг/л.

ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДНОГО ПИТАНИЯ:

Углеводы — наиболее часто используемые в процессах ферментации вещества. К ним относятся приведенные  ниже соединения.  
Глюкоза влажность — до 9%, зола — до 0,07%, в том числе железо — не более 0,004%.  
Сахароза влажность — до 0,15%, зола — до 0,03%.  
Лактоза С12Н22011 (получается из молочной сыворотки); лактоза — 92%, влажность — до 3%, зола — до 2%, белок — около 3%, молочная кислота — до 1%.  
Крахмал В зависимости от сорта зола 0,35—1,2%.  
Гидрол — отход крахмало-паточного производства. Представляет собой густой темный сироп с запахом. Содержит до 50% углеводов, в основном глюкозу, а также органические кислоты. Часть сахаров не сбраживается. Зольность — до 6%.  
Меласса — отход производства сахара (уларенная маточная жидкость после отделения кристаллов сахара). Имеет темно-коричневый цвет, плотность 1,35—1,4 г/мл. Содержит 40—55% сахарозьт, 0,5—2% инвертного сахара. Имеется 1,1—1,5% азота, причем третья часть его — в форме бетаина, который микроорганизмам не используется. Содержит также аминокислоты и витамины группы В (биотин — до 80 мг/т). В золе много калия, магния, кальция, железа, но мало фосфора. Меласса — продукт сезонный. При хранении могут быть потери сахаров в результате деятельности микроорганизмов.  
Кукурузная мука содержит 67—70% крахмала, 10% других углеводов, около 12% белков. Влажность — до 15%, зола — до 0,9%. В золе есть много фосфора, калия, магния.  
Пшеничные отруби — отход мукомольного производства, используются в твердофазной ферментации. Содержат 16—20% крахмала, 10—12% белков, 10% клетчатки, 3—4% жиров.  
Молочная сыворотка (творожная, подсырная). Содержит до 4— 4,7% лактозы, 0,5—1,0% белков, 0,2—0,3% жиров, органические кислоты.  
Недостаток — нестабильность при хранении, которого в значительной степени лишены сухая и сгущенная сыворотки.  
Свекловичный жом — отход сахарного производства, содержит пектины и целлюлозу — до 22% и до 65% «безэкстрактивных веществ», белки — до 9%.  
Гидролизаты древесины. Сама древесина является не очень «вкусным» сырьем для микроорганизмов, но после предварительной обработки — высокотемпературного кислотного гидролиза — превращается в гидролизаты. Целлюлоза и пентозаны гидролизуются до глюкозы и других сахаров. Содержание сахаров зависит от породы древесины и технологии гидролиза и составляет 4—8%. Кроме древесины можно использовать для тех же целей различные целлюлозосодержащие сельскохозяйственные отходы (солому, кукурузные кочерыжки, стебли хлопчатника и т.п.).  
Сульфитные щелока — отход целлюлозно-бумажного производства, продукт гидролиза лигнина и гемицеллюлозьт, содержит сбраживаемые сахара (до 3,5%).  
Гидролизаты торфа — получают после кислотного гидролиза торфа, который содержит полисахариды до 50% от их содержания в древесине. Упаренный гидролизат имеет 25—30% редуцирующих веществ, а также азот и фосфор в доступной для микроорганизмов форме.  
Сок растений (коричневый сок) — до 2% сахаров.  
Отходы спиртового производства (картофельная или зерновая барда — содержат от 2,0 до 2,9% редуцирующих веществ).  
Картофельный сок — содержит до 1% углеводов (крахмала).  
НЕУГЛЕВОДНЫЕ ИСТОЧНИКИ  УГЛЕРОДА:

Углеводороды жидкие — парафины с длиной углеродной цепи. Используются в производстве кормовых дрожжей, лимонной кислоты, биопрепаратов — деструкторов нефти.  
Углеводородные газы — метан, этап, пропан, бутан — применялись для получения кормового белка и некоторых продуктов переработки биомассы (в том числе феромонов).

Спирты. Э т а н о л используется для выращивания кормовых дрожжей, производства уксусной кислоты и многих других биопродуктов.  
Ме тиловый спирт, хотяиявляетсяядомдлячсловека, очень подходит для культивирования многих видов микроорганизмов — кормового белка и продуктов их переработки (например, убихинонов — средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний).  
Уксусная кислота — (синтетическая) иногда используется как источник углерода при получении аминокислот микробиологическим синтезом.  
Жиры и масла. В историческом аспекте жиры и масла сначала применяли как средство для предотвращения пенообразования в процессах ферментации.  
Например, в производстве тетрациклина долгое время использовали кашалотовый жир, пока международная конвенция не наложила запрет на промысел кашалотов и китов. для предотвращения вспениваемости стали применять синтетические поверхностно-активные вещества — пеногасители. Тогда и выяснилось, что кашалотовый жир был нужен продуценту тетрациклина и как источник углеродного питания.  
Пришлось заменять его свиным жиром (лярдом), растительными маслами. Говяжий и бараний жир, а также пальмовое масло использовать более трудно, так как они при обычной температуре являются твердыми продуктами.  
Среди растительных масел в процессах ферментации применяют подсолнечное, соевое, арахисовое, льшiное, рапсовое, кастороное, кокосовое масла, иногда даже масло бобов какао.  
Надо отметить, что излишнее употребление жиров приводит к трудностям на стадиях выделения и очистки продукта.  
ЭКЗОТИЧЕСКИЕ УГЛЕРОДНЫЕ СУБСТРАТЫ:

Довольно медленно используется микроорганизмами лигнин — отход гидролизного производства.  
В лабораторной практике часто применяют агаризованные среды — на основе агара — полисахарида из морских водорослей.  
Хитин — покрытие насекомых и морских моллюсков, некоторых грибов — пока без больших успехов пытаются использовать как углеродный компонент питательных сред. Еще меньшие результаты дает использование каменного угля и слан цен (конечно, с предварительной термохимической обработкой).  
ИСТОЧНИКИ АЗОТНОГО ПИТАНИЯ:

Многие микроорганизмы способны утилизировать источники неорганического азота:  
сульфат аммония (чаще всего);

Нитрат аммония;  
карбамид;  
аммиачная вода (используемая одновременно как источник азотного питания и как титрант для поддержания заданной величины рН).  
Часто для процессов ферментации в состав среды требуется включать источники органического азота, действующим началом которых являются аминокислоты и белки. Сырьем при этом могут быть различные натуральные продукты растительного и животного происхождения. Рассмотрим наиболее распространенные из этих продуктов.  
Кукурузный экстракт — отход крахмало-паточного производства, получаюшийся путем упаривания жидкости от замачивания («настоя») кукурузных зерен («замочная жидкость») с содержанием сухих веществ не ниже 48%. В процессе замачивания происходит  ферментативный гидролиз белков кукурузы, вследствие чего около половины азотсодержащих веществ экстракта представляет собой смесь аминокислот, полипептидов и белков. Экстракт — темная вязкая жидкость, содержит 6,4—8% общего азота, не более 24% зольт. В золу входят фосфор, калий, магний, причем фосфор — до 5%, частично в связанном состоянии в виде фитина. Имеются также витамины группы В (биотин), ростовые вещества и биостимуляторы. Таким образом, кукурузный экстракт представляет собой хорошую смесь различных источников питания, что предопределило его использование во многих рецептурах сред.  
Традиционно кукурузный экстракт используется при биосинтезе пенициллина. И хотя его применение имеет недостатки (например, темный пигмент сохраняется на стадиях очистки и его приходится сорбировать в дальнейшем активированным углем), попытки замены этого источника питания другими обычно приводят к снижению продуктивности процесса ферментации.  
Соевая мука получается при размалывании соевого зерна, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла. В зависимости от этого получается обезжиренная, необезжиренная и полуобезжиренная мука. Бывает еще дезодорированная (обработанная паром) соевая мука, что позволяет ей храниться в течение года. В недезодорированной муке сохраняются ферменты, в связи с чем срок хранения ее не превышает 1,5—3 месяца.  
В соевой муке содержится до 45% протеина и 32% углеводов, так что ее можно использовать и как источник углерода. В состав ее золы (4,5—6,5%) входит калий, кальций и магний, а также довольно много фосфора.  
Соевая мука наряду с кукурузным экстрактом является прекрасным источником азотного, углеродного и фосфорного питания.  
Недостаток соевых сред — сильная вспениваемость и некоторые трудности выделения продукта из-за наличия твердого осадка.  
Выпускают продукт в сельскохозяйственном секторе, где еще  
не очень налажена культура производства. Например, качество со- евой муки в ГОСТе определялось по такому показателю, как «хруст на зубах при разжевывании» (в случае, когда в муке имеются механические примеси — песок и т. п.).  
Мука семян хлопка содержит 41% протеина и до 29% углеводов. На ее основе путем определенной переработки готовится среда с фирменным названием <Фарма-медиа>, имеющая до 59% белков и 24% углеводов. Эта среда используется на Западе для получения многих антибиотиков.  
Мука семян льна содержит 36% протеинов и 38% углеводов.  
Арахисовая мука — 45% протеина, 5% жира и 23% углеводов.  
Рыбная мука содержит до 65% белков и в некоторых случаях используется в качестве компонента сред.  
Кровяная мука является чемпионом по содержанию белка — до 80%.  
Мясокостная мука содержит до 50% белков.  
Сухое молоко обезжиренное содержит лишь 34% белка. Тем не менее молочные белки (казеин, сьтвороточньте белки) в виде гидролизатов часто используются как компоненты питательньих сред.  
Продукты пер еработки животного сырья — желатин, белкозин — таюке содержат органический азот, приемлемый для использования в качестве компонента сред.  
дрожжевые автолизаты, ферментолизаты, гидролизаты в высушенном виде содержат до 52% органического азота, в основном в виде смеси аминокислот.  
Мясной и рыбный пептоны используются для лабораторньтх питательньтх сред. Полная аналогия супа, бульона или студня. К тому же используются довольно качественные пищевые продукты.  
ДРУГИЕ ВИДЫ СЫРЬЯ:

 Источники фосфорного питания. Часто упоминавшиеся ранее источники органического азота (например, кукурузный экстракт, соевая мука) являются одновременно и источниками фосфора.  
Неорганические источники также содержат азот. Это — аммофос (смесь моно-, ди- и триаммонийфосфата), отдельно МАФ (моноаммонийфосфат) и дАФ (диаммонийфосфат).  
Иногда применяют ортофосфорную кислоту, но обычно это наиболее дорогой источник фосфорного питания.  
Макро- и микроэлементы. Используются в основном неорганические соли.

 Титранты для корректировки рН. Мел позволяет стабилизировать величину рН без добавления других титрантов. Обычно используют мел хiiмически осажденный, а не природный, особенно в фармацевтической биотехнологии. В качестве титрантов применяют также кислоты и щелочи.  
Пеногасители. Используются различные виды жиров, олеиновая кислота, различные модификации поверхностно-активных веществ: пропинол, лапрол и др.  

6. ОСНОВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ  ФЕРМЕНТАЦИИ

Рассмотрим теперь более подробно периодическую ферментацию. Основные параметры процесса. После того как в аппарат загрузили среду, создали необходимую температуру, добавили посевной материал и стали подавать воздух для аэрации, собственно , и начался процесс ферментации. Как следить за протеканием этого процесса? для этого необходимо время от времени или непрерывно определять, какие изменения происходят в ферментационной среде.  
Обычно состояние процесса характеризуется следующими основными параметрами:  
концентрация биомассы микроорганизмов Х;  
концентрация питательной среды — субстрата (или его основного компонента)  
концентрация продукта Р.  
Все эти концентрации приведены к единице объема среды.  
Фазы периодической ферментации. Рассмотрим, как изменяется концентрация биомассы в процессе периодической ферментации (фазы ферментации) .  
В начале ферментации некоторое время микроорганизмьт как бы приспосабливаются к новой среде, их концентрация не меняется. Этот период называется лаг-фаза. далее начинается рост — это фаза ускорения роста. Третья фаза — фаза наиболее интенсивного роста, происходит наибольший относительный прирост био- массы. Это фаза экспоненциального роста. Затем скорость роста (относительная) начинает уменьшаться — это фаза замедления роста. достигнув некоторой максимальной величины, концентрация биомассы далее перестает возрастать.  В этой фазе — стационарной --- в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты обмена, тормозящие рост. Биомасса растет и одновременно происходит гибель части клеток (автолаз), так что общая концентрация сохраняется постоянной. И наконец, в фазе отмирания автолиз начинает преобладать над ростом, и концентрация биомассы микроорганизмов снижается.  

Определение фаз ферментации  по кривой роста биомассы                 Фазы ферментации в полуграфической

во времени в периодическом  процессе.                                                   системе координат. 

биомассьт далее перестает возрастать. В этой фазе — стационарной --- в  среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты обмена, тормозящие рост. Биомасса растет и одновременно происходит гибель части клеток (авшолаз), так что общая концентрация сохраняется постоянной. И наконец, в фазе отмирания автолиз начинает преобладать над ростом, и концентрация биомассы микроорганизмов снижается.  
Эту кривую лучше изображать в полулогарифмических координатах.  
Здесь участок роста, имеющий постоянный наклон, сразу выделяет фазу экспоненциального роста. Остальные фазы также легко определяются.

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОЦЕССА

Кинетические характеристики процесса отражают скорость протекания биохимических  гтревращений. Эти превращения, естественно, отражаются на всех указанных участниках процесса — биомассе, продукте и  субстрате.  
Киветические показатели роста биомассы. Важным показателем процесса является скорость роста биомассы. Хотя сам вид кривой очень похож для различных микроорганизмов, время ферментации существенно различается. Для быстрорастущих бактерий весь цикл может закончиться за несколько часов, а для мицелиальных микроорганизмов или изолированных клеток растений время составляет недели и месяцы.  
дая описания скорости роста используется такая характеристика, как общая скорость роста. Этот показатель не вполне отражает физиологическое состояние биомассы в процессе его роста.   
В первом процессе исходная концентрация биомассы меньше, во втором — больше. Поэтому хотя абсолютный прирост биомассы АХ за одинаковое время А (такой же, относительный прирост АХ/Х0 различается существенно: впервом случае количество биомассы возрастает в несколько раз по отношению к начальному, а во втором — по отношению к начальной биомассе рост составляет всего 20—30%. Ясно, что биомасса «работает в этих двух процессах по-разному, хотя и «выдает» одинаковое количество продукции за то же время.  
Обычно больший интерес д.ля характеристики интенсивности роста представляет не величина , а удельная скорость роста в  
пересчете на единицу биомассы (ведь рост биомассы пропорционален концентрации клеток):

МАКРОСТЕХИОМЕТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ  
ПРОЦЕССА

Все рассмотренные ранее характеристики  являются выражением скорости изменения  того или иного параметра во времени, т.е. кинитическими характеристиками.  
Наряду с этими характеристиками важное значение имеют и так называемые макростехиометрические, которые выражают взаимосвязь между приростом биомассьг, продукта и расходованием субстрата.  
Простейшей такой характеристикой процесса ферментации является выход по субстрату, или экономический коэффициент (или коэффициент выхода). Его определяют, сравнивая количество выросшей за весь цикл ферментации биомассы Х к количеству загруженного субстрата (проще говорить об их концентрациях, чтобы абстрагироваться от объема среды):