Разработка наилучшего способа выделения и очистки инсулина из поджелудочной железы свиньи

                                          Российская федерация

Министерство образования и науки

Федеральное агентство по образованию 
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования 
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МАШИНОСТРОИТЕЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 

 

 

Факультет – Экологический 
Кафедра - Экологическая и промышленная биотехнология

 

 

 

Курсовая работа

по дисциплине «Основы биохимии и молекулярной биологии» 
на тему 
«Разработка наилучшего способа выделения и очистки инсулина из поджелудочной железы свиньи» 

 

 

 

 

 

Выполнила: студентка Коржова И.Е. 
группы Н-34 
Проверила: доц. Горшина Е.С.

 

                                             

                                                 Содержание

Введение………………………………………………………………………..3

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Электрофорез в полиакриламидном геле………………………………...4

1.2.Ионообменная хроматография…………………………………………....4

1.3. Высаливание…………. …………………………………………………...4

1.4.Способы выделения и  очистки инсулина………………………………...5

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Материалы исследований………………………………………………....7

2.2.Методы исследований……………………………………………………..7

ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Выделение гормона инсулина из поджелудочной железы свиньи……..8

3.2. Обработка спиртового экстракта поджелудочной железы……………...8

3.3.Отделение осадка центрифугированием………………………………….8

3.4.Хроматография надосадочной жидкости на сульфокатионите………...8

3.5.Элюция целевого продукта натрий-фосфатным буферным раствором..8

3.6.Кристаллизация в виде  солей цинка……………………………………...8

3.7.Хромотография на гидрофобном носителе "Адан"………………………8

3.7.Контроль чистоты получаемого продукта с помощью электрофореза в полиакриламидном геле……………………………………………………….8

3.8.Элюция инсулина…………………………………………………………...8

3.9.Лиофильная сушка инсулина………………………………………………8

Выводы………………………………………………………………………….9

Список литературы…………………………………………………………...10

 

Введение

   Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенный гормон инсулин применяют в медицине как лекарственный препарат для лечения сахарного диабета, кроме того очищенный инсулин часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях [1].

   Инсулин оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в снижении концентрации глюкозы в крови [2].

   Основной проблемой получения инсулина является полная очистка конечного продукта от малейших примесей. Даже незначительные примеси белковых компонентов вследствие кумулятивного эффекта в процессе лечения могут привести к летальному исходу. В лучших образцах производства содержание примесей не превышает 1%, однако, и столь малые примеси в препаратах инсулина могут вызывать аллергические реакции [4].

 

Целью данной работы является разработка быстрого и дешевого способа выделения инсулина и повышения чистоты целевого продукта.

 

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Электрофорез в полиакриламидном геле.

   Метод основан на том, что при определенном  значении pH и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положительно заряженные белки – к катоду.

   В полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам [3].

1.2.Ионообменная хроматография.

   Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определенных значениях pH и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нем в результате электростатических взаимодействий.

   В качестве неподвижной фазы используют ионообменники – полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы [3].

1.3.Высаливание.

   Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щелочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

   Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония [3]. 

 

 

 

1.4.Способы выделения  и очистки инсулина.

   Начальный этап выделения инсулина из поджелудочной железы животных заключается в экстракции гормона из ткани с помощью этилового спирта высокой концентрации, подкисленного до рН 2,0-3,5, как правило, одной из сильных неорганических кислот. Дальнейшее выделение инсулина из спиртового экстракта имеет несколько решений [4].

   Известен способ выделения инсулина [5] из спиртового экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, в котором инсулин сорбируется на макропористом сульфополистирольном катионите КУ-23 при рН 2,4 без предварительной депротеинизации экстракта. После сорбции смолу последовательно промывают  этиловым спиртом и уксусно-аммонийным буфером (рН 5,0-5,3). Элюцию инсулина со смолы проводят соляно-аммонийным буферным раствором (рН 9,4-9,6), содержащим 15-20% этилового спирта. Элюат подкисляют до рН 2,0, осадок отфильтровывают. Фильтрат доводят концентрированным аммиаком до рН 4,4.Выпавший осадок удаляют, а к супернатанту при рН 6,0 добавляют 10%-ный раствор ацетата цинка для осаждения аморфного цинк-инсулина.

   Недостатком данного метода является довольно низкая активность получаемого продукта, что свидетельствует о возможном присутствии больших количеств примесных соединений.

   Освободиться от примесных соединений (особенно от белков, близких по молекулярному весу и родственных белков - проинсулин, дезамидоинсулины, аргинин- и диаргинин-инсулины, этиловые эфиры инсулина) можно только с помощью ионнообменной хроматографии с использованием в качестве элюентов систем, вызывающих диссоциацию компонентов смеси. Разработан способ очистки на сильном анионите [6], при котором снятие инсулина с сорбента осуществляют с помощью водно-спиртовых растворов рН 5,5-10,0. Одним из возможных вариантов очистки инсулина рассмотрена также хромотаграфия на декстрановом геле типа с размером частиц 0,08-0,1 мм и элюцией уксусной кислотой. Это позволяет освободиться от высокомолекулярных белков, проинсулина и белков, близких к инсулину по молекулярной массе.

   Недостаток: в вышеупомянутых методах очистки инсулина в хроматографическом процессе собирают только центральную часть фракций, содержащих инсулин, что неизменно ведет к потере целевого продукта.

   Известен также способ выделения [7], в котором перед сорбцией инсулина на катионите проводится трехкратное удаление белка из спиртового экстракта. Первую депротеинизацию осуществляют с помощью хлористого кальция при рН 3,5-3,8. После отделения осадка фильтрат подщелачивают до рН 4,7-5,1 и вновь выпавший осадок убирают центрифугированием. В третий раз осаждение белков проводят в течение 2-3 часов при рН 3,7-3,9 и охлаждении смеси до 0-6o С. После отделения осадка фильтрат пропускают через колонку с сульфокатионитом КУ-23 и далее обработку ведут известным способом. Цинк-инсулин перекристаллизовывают из водного раствора лимонной кислоты, содержащем ацетон, и получают кристаллический инсулин.

   Основными недостатками метода являются: многостадийность, что делает его трудо- и энергоемким; значительное число операций проводится с большими объемами растворов, что затрудняет соблюдение санитарных норм производства; довольно низкая активность целевого продукта.

  Изучив известные методы выделения и очистки инсулина, мы сделали вывод, что все они обладают рядом недостатков. Таким образом, актуальной является разработка наилучшего способа выделения и очистки инсулина из поджелудочной железы свиньи, в котором будут устранены эти недостатки. Полученный инсулин в дальнейшем будет использоваться фирмой «Sigma-Aldrich» в биохимических исследованиях.

   Разработанный нами  метод выделения и очистки инсулина из поджелудочной железы свиньи обладает следующими преимуществами:

1.Сокращено количество операций, что в свою очередь значительно удешевляет весь процесс и сокращает время его проведения.

2. После второй операции рабочие объемы уменьшаются практически в 10 раз, что упрощает технологию и облегчает соблюдение санитарных норм производства.

3.Количество энергоемких операций (центрифугирование, упаривание) сокращено до минимума.

4.По данным электрофореза в полиакриламидном геле, снижено содержание сопутствующих белковых примесей в инсулине.

5. Метод прост в реализации, не требует дорогостоящего оборудования.

 

 

ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.Материалы исследований 

   Для данного исследования  использовали:

1.Поджелудочная железа свиньи;

2.Раствор концентрированного аммиака(pH 9);

3.Этиловый спирт 65%;

4.Концентрированный раствор серной кислоты;

5. Ацетат цинка 1%;

6. Фосфатный буфер (рН 7,0-8,5);

7. Центрифуга SIGMA 2-6 / 2-6E;

8.Хроматографическая колонка "Адан" с гидрофобным носителем на основе макропористого стекла;

9.Хроматографическая колонка на основе силикагеля.

 

2.2.Методы исследований.

1.Осадок отделяли методом  центрифугирования [3];

2. Балластные белки удаляли методом ионообменной хроматографии [3];

3.Чистоту продукта проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле [3].

 

ГЛАВА 3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Выделение гормона инсулина из поджелудочной железы свиньи;

3.2.Обработка спиртового экстракта поджелудочной железы;

3.3.Отделение осадка центрифугированием;

3.4.Хроматография надосадочной жидкости на сульфокатионите;

3.5.Элюция целевого продукта натрий-фосфатным буферным раствором;

3.6.Кристаллизация в виде  солей цинка;

3.7.Хромотография на гидрофобном носителе "Адан";

3.7.Контроль чистоты получаемого продукта с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;

3.8.Элюция инсулина;

3.9.Лиофильная сушка инсулина.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выводы

   Разработанный метод выделения и очистки инсулина из поджелудочной железы свиньи обладает следующими преимуществами:

1.Сокращено количество операций, что в свою очередь значительно удешевляет весь процесс и сокращает время его проведения.

2. После второй операции рабочие объемы уменьшаются практически в 10 раз, что упрощает технологию и облегчает соблюдение санитарных норм производства.

3.Количество энергоемких операций (центрифугирование, упаривание) сокращено до минимума.

4.По данным электрофореза в полиакриламидном геле, снижено содержание сопутствующих белковых примесей в инсулине.

5.Метод прост в реализации, не требует дорогостоящего оборудования.

 

Список литературы

1. Степанов В.М. «Структура и функции белков». Высшая школа; 1996; 335стр.;

2.Теппермен Дж., Теппермен Х. «Физиология обмена веществ и эндокринной системы». М.: Мир, 1989, 656стр.;

3.В.В. Сова, М.И. Кусайкин «Химия и биохимия белков и ферментов». 2006,120стр.;

4. Скоупс Р. «Методы очистки белков». Мир; 1985; 358стр;

5. Патент № 389793(СССР);

6. Патент № 41295690(США);

7. Патент № 3878186(США).