Перспективы использования ДНК технологий в селекции сельскохозяйственных животных

Поступательный рост коммерческих исследований на подтверждение достоверности происхождения методами ДНК-анализа отмечается в коневодстве, где эти методы постепенно вытесняют иммунно-генетические. Число образцов, исследованных во ВНИИ коневодства, увеличилось с 4 в 2008 году до более 3 000 в 2012 году, отмечает Н.А. Зиновьева [2].

Маркирование признаков продуктивности.

Среди множества генов, контролирующих хозяйственно - полезные признаки, можно выбрать группу мажорных генов, вносящих наибольший вклад в формирование и функционирование данных признаков. Современные методы молекулярной биологии (ПЦР, ПДРФ и др.) позволяют быстро идентифицировать гены, ответственные за количественные признаки животных, оценить их сочетание (генотип) у производителей и молодняка. Значительную помощь селекции в молочном животноводстве может оказать генетическая информация об аллельных вариантахгенов, кодирующих синтез белков (казеинов, бета-лактоглобули-на молока), и их сочетаниях в геноме, пишет Л.А. Калашникова [5].

Анализ мировых информационных ресурсов позволил выделить ряд потенциальных ДНК-маркеров продуктивных признаков крупного рогатого скота и свиней, для определения полиморфизма которых разработаны аналитические тест-символы (таблица 1).

Таблица 1

Спектр потенциальных ДНК-маркеров продуктивности крупного рогатого скота и свиней

*Указаны только диагностируемые аллели; потенциальный «желательный» аллель выделен жирным шрифтом.

 Как показано  в таблице 1, предполагаемые для  внедрения в сельхозпредприятиях России маркеры крупного рогатого скота затрагивают, главным образом, показатели молочной продуктивности. Диагностируемые маркеры свиней охватывают более широкий спектр экономически значимых показателей: многоплодие, сохранность поросят, качество мяса, откормочная и мясная продуктивность, пишет Н.А. Зиновьева [3].  

Исследования показали полиморфизм всех изучаемых ДНК-маркеров, при этом частоты встречаемости желательных аллелей характеризуется достаточно высоким размахом  изменчивости  в зависимости от породной

принадлежности животных и используемой селекционной стратегии.

Внедрению маркерной селекции должен предшествовать анализ распределения аллелей  в генотипе каждого из потенциальных ДНК-маркеров.

В качестве задач на ближайшую перспективу ставится дальнейшее расширение спектра маркеров и разработка мультилокусных систем анализа, позволяющих выполнять одновременный анализ полиморфизма нескольких генов и направленных на снижение себестоимости и повышение производительности ДНК-диагностики, пишет Н.А. Зиновьева [3].

Полиморфизм гена каппа-казеина крупного рогатого скота

Основная часть белков молока (78-85%) представлена казеинами. На сегодняшний день известно семь аллелей каппа- казеина крупного рогатого скота: А, В, С, Е, F, G, Н. Изучение гена каппа-казеина показало существование нуклеотидных замен, которые характеризуют различные аллельные варианты.

Из всех известных аллельных вариантов каппа-казеина выделяют В-аллельный вариант, который ассоциируется с более высоким содержанием белка в молоке и более высоким выходом сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока, отмечает Л.А. Калашникова [5].

Ранее генотип казеина не включали в показатели селекции, так как производители могли быть оценены только в зрелом возрасте путем типирования молочных белков их потомства. Благодаря методу полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом стало возможным идентифицировать генотип каппа-казеина на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение селекционных задач. Сегодня во многих генетических- центрах мира проводят исследования крупного рогатого скота по идентификации и рациональному использованию казеиновых генотиплв [5].

Полиморфизм гена соматотропина крупного рогатого скота

Соматотропин наряду с функцией регуляции роста животных обладает лактогенным, инсулиноподобным, диабетогенным, жиромобилизующим и нейротропным действием. Регуляторная функция соматотропного гормона реализуется не только в прямом действии на органы - мишени, клетки которых имеют специальные рецепторы на плазматических мембранах, но и в модифицирующем, "пермиссивном" влиянии на эффекты других гормонов и биологически активных соединений.

Развитие техники анализа нуклеиновых кислот позволило перенести исследование генетического полиморфизма на уровень ДНК, что позволяет выявить все возможные варианты конкретного гена. Ген гормона роста (GH - growthhormone) состоит из более 2 тысяч пар оснований. Изменения, которые могут в них происходить (делеции, инсерции, замены и др.), означают образование новых аллелей гена. На уровне структуры белка генетический полиморфизм проявляется лишь только в том случае, если различия между ДНК-аллелями связаны со значащими изменениями в кодирующей части, отмечает Л.А. Калашникова [5].

У европейских пород крупного рогатого скота на уровне белка идентифицированы два аллеля соматотропина, они различаются аминокислотными остатками в положении 127 полипептида. Нуклеотидная замена в V экзоне кодона Leu (СТО) на кодон Val (GTG) приводит к появлению аллельных вариантов и является причиной замены аминокислоты лейцина на валин в положении 127 полипептидной цепи. Аллельные варианты соматотропина, связанные с положением 127 полипептида, наблюдаются у всех изученных пород.

В работе M.C.Luci и соавторов (1993) описано влияние генотипов с аллельными вариантами, связанными с наличием валина либо лейцина в положении 127 полипептидной цепи, на молочную продуктивность. Из представленных в работе данных следует, что гомозиготные коровы по аллелю валина имели более высокую молочную продуктивность.

Диагностика наследственных заболеваний.

 Одним из элементов системы генетической паспортизации сельскохозяйственных животных является контроль над распространением наследственных заболеваний. Сегодня   разработаны и внедрены системы анализа 11 генов наследственных заболеваний у 4 видов сельскохозяйственных животных. Наиболее интенсивно работы ведутся в свиноводстве и скотоводстве, где риск распространения наследственных аномалий особенно велик вследствие интенсивного использования искусственного осеменения и стратегии селекции на лидера, отмечает Н.А. Зиновьева [2].

 Диагностика мутации BLAD и CVM крупного рогатого скота

Особенности ведения современного сельского хозяйства в мировом масштабе приводят к появлению ряда новых проблем. Широкий обмен генетическим материалом между разными странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний (например, губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота в Англии), а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается очень высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб в результате их распространения приводит к необходимости строгого генетического контроля импортируемого генетического материала.

Высокая скорость распространения неблагоприятных мутаций возможна только при рецессивном характере их наследования. Не исключено, что быстрое распространение отдельных рецессивных мутаций у сельскохозяйственных видов обусловлено преимуществом гетерозигот в отношении проводимого человеком искусственного отбора.

BLAD (BovineLeukocuytesAdhesionDeficiency), снижение адгейзии лейкоцитов крупного рогатого скота.

Единственным существующим к настоящему времени методом, позволяющим безошибочно выявить носительство мутации BLAD в гетерозиготе, является анализ продуктов амплификации участка гена CD 18 по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов с использованием рестриктаз TaqI и НаеШ.

В 2001 году группа датских ученых объявила, что обнаружен ген, вызывающий CVM (ComplexVertebralMalformation) –комплексное уродство позвоночника и разработан тест для его идентификации. Ученые заявили, что CVM становится мировой проблемой в селекции голштинского скота.  Благодаря современным ДНК-технологиям CVM-носители могут быть выявлены в молодом возрасте, тем самым появилась возможность управлять генетической ситуацией в породе, пишет Ю.Н. Козлов [6].

На сегодняшний день проведена большая работа в области анализа рецессивных вредных мутаций (BLAD и CVM). На BLAD проверено 275 быков и на CVM-561 бык производитель станции искусственного осеменения, обнаружена достаточно высокая частота этих мутаций, и быки носители уже выбракованы, что предотвратило  серьезную генетическую опасность этих мутаций для скотоводства, отмечал Л.К. Эрист [7].

Диагностика стрессчувствительности свиней по RYRl-гену

При селекции на мясность часть животных приобретает отрицательные признаки - чувствительность к воздействию стресс- факторов (транспортировка, физическая нагрузка, температура, иммобилизация, галотановый наркоз) и низкое качество мяса (бледное, водянистое, мягкое). Эти признаки имеют генетическую природу, затрагивающую галотановый локус. Повышенная чувствительность к стрессам ведет к экономическому ущербу за счет плохого качества свинины и внезапной смерти животных. Уровень потерь зависит от генетического состава животных [5].

Исследования галотанового локуса генома свиней позволили выявить мутацию в рианодоин - рецепторном гене (RYR1- ген). Показано, что мутация в RYRl-гене является причиной чрезмерно острой реакции свиней на стресс - злокачественного гипертермического синдрома. Наличие этой мутации подтвердилось у различных пород свиней, и было установлено её рецессивное  наследование. На основании анализа последовательности ДНК был предложен метод генной диагностики предрасположенности свиней к стрессам и сконструированы праймеры для ПЦР-анализа аллельных вариантов RYR1 - гена (Г. Брэм, Б. Бренинг, 1993).

Результаты анализов, проведённых в лаборатории биохимической генетики ВНИИплем, указывают, что свиньи новой специализированной скороспелой мясной породы (СМ1) имеют в своем геноме ген, поврежденный мутацией и несущий предрасположенность к стрессам. Частота встречаемости мутантного аллеля составляет в среднем 0,04. Носителями гена в гетерозиготной форме являются 13% хряков и 5% свиноматок.

По результатам проведённых исследований можно заключить, что селекция на мясность сопровождается появлением дефектных генов у свиней крупной белой породы, которая в целом характеризуется высокой устойчивостью к стрессам. Частота гетерозиготных носителей дефектных аллелей у животных мясного направления крупной белой породы составляет в разных регионах Российской Федерации от 2,4% до 9,0%.

Гетерозиготные животные являются фенотипически устойчивыми к стрессу, поэтому особое значение приобретает выявление носителей дефектного аллеля методами генной диагностики. Использование метода ПЦР-ПДРФ позволяет выявить у животных наличие скрытых мутаций в составе гетерозиготного генотипа и контролировать распространение мутантного гена в популяции, пишет Л.А. Калашникова [5].

Диагностика инфекций

Общеизвестно, какое огромное распространение имеет лейкоз, в нашей стране и в мире им поражены десятки миллионов животных. Попытка создания вакцины не увенчалась успехом, отмечал Л.К. Эрнст [7]. Поэтому точная и точная диагностика играет огромную роль в выявлении носителей лейкоза.

Диагностика инфицированности крупного рогатого скота вирусом бычьего лейкоза (BLV- BovineLeukemiaVirus) до сих пор выполняется по оценке наличия у животных антител к антигенам BLVс помощью РИД диагностики. Выполнение такого анализа возможно у животных только после 6 месяцев постнатального развития, его точность зависит от используемых вирусных антигенов и титра антител в крови животного. Метод характеризуется невысокой точностью - известно, что РИД - положительный диагноз подтверждается при патологоанатомическом анализе только в 1 - 8 % случаев (Н.И.Баскаков, А.А.Манько, 1991).

В последнее время все большее распространение получают методы выявления инфекционных агентов путем тестирования присутствия их генетического материала в различных клеточных популяциях хозяина с использованием ПЦР.

В Институте агроэкологии и биотехнологии УААН разработан метод выявления генетического материала BLVв лейкоцитах крупного рогатого скота. Наилучшие результаты были получены с использованием праймеров к гену Env (Y.Yoshinakaetal., 1986).

Размер продуктов амплификации ДНК из культуры FLJC воспроизводился от эксперимента к эксперименту и четко соответствовал заданному по первичной последовательности генов. Он составлял для гена Env- 367 пн, для гена Gag- 364 пн. Выполненные исследования на клеточной культуре FLK, инфицированной вирусом BLV, позволили нам прийти к заключению, что данные две пары праймеров позволяют выявлять наличие интегрированной в клеточный геном ДНК провирусаBLV.